临床色谱质谱检验技术：液相色谱质谱技术（一）

第五章液相色谱质谱技术2016.04.21《临床色谱质谱检验技术》一、本章教学要求二、液相色谱质谱联用技术概述三、液相色谱质谱联用仪系统五、小结与思考《临床色谱质谱检验技术》主要内容四、液相色谱质谱联用方法建立（一）一、本章教学要求《临床色谱质谱检验技术》目标掌握：液相色谱-质谱联用仪的组成液相色谱-质谱联用方法的建立液相色谱-质谱联用技术临床应用的要求熟悉：液相色谱-质谱联用仪的工作原理液相色谱-质谱联用的接口问题液相色谱-质谱联用技术在临床方面的应用第五章教学要求教学形式及学时理论教学学时：5学时实践教学学时：6学时第五章教学要求二、液相色谱质谱联用技术概述《临床色谱质谱检验技术》气相色谱质谱联用技术的定义？优势？应用局限？定义：将气相色谱的分离能力与质谱的鉴定能力结合起来进行定性定量分析的基本分析技术。优势：既解决了气相色谱定性的不专一性，也解决了质谱要求样品纯度高的局限性，二者优势互补，将气相色谱作为进样系统，质谱作为检测器。局限：适合分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物（仅占已知化合物20%），但不适用不稳定和不挥发性物质分析。复习已知化合物中约80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，只能依靠液相色谱进行分离。液相色谱质谱联用技术出现的原因？高分离能力适用广高灵敏度和高特异性1912J.J.Thompson（英国剑桥大学）研制出世界上第一台现代意义质谱仪30's-50's相继研制出双聚焦质谱仪、电磁扇形质量分析器质谱仪、四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪1960's开发气相色谱质谱联用仪1974E.C.Horning将大气压化学离子化（APCI）用于液相色谱质谱联用1984JohnFenn发明电喷雾离子化技术（ESI）1988电喷雾离子源质谱仪首次应用于蛋白质的分析1989第一台商业化电喷雾源的液相色谱质谱联用仪诞生1990GaryJ.VanBerkel将离子阱质谱与ESI成功联用20世纪90年代以后，液相色谱质谱联用广泛应用于各个领域，特别是在临床检验上的应用也得到长足发展。液相色谱质谱联用技术发展史三、液相色谱质谱联用仪系统《临床色谱质谱检验技术》液相色谱质谱联用仪的组成

1、液相部分（包括输液系统、进样系统、色谱柱、柱温箱）2、质谱部分（包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统）3、数据处理系统数据处理系统液相部分质谱部分液相色谱质谱联用仪的组成及工作原理质谱部分数据处理（计算机）系统可以同时控制液相色谱、质谱部分、以及数据采集和处理分析，是液相色谱质谱联用仪的中央控制单元。（1）如何解决样品从常压下液态分子到真空下气态离子的问题（降低色谱与质谱间的工作压力差）（2）去除流动相，保留样品，电离化合物（3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染如何实现液相色谱质谱联用？液相色谱质谱联用的主要困难液相（LC）质谱（MS）高压液相操作（流速大）要求高真空液体进入离子源转变为大量气体只允许有限的气体进入离子传输系统质量范围无限制测定质量取决于m/z和质谱仪的类型常常使用无机盐缓冲剂需采用挥发性缓冲盐解决思路扩大MS真空系统的抽气容量在引入真空系统之前除去溶剂分流流出物，牺牲灵敏度使用可在较低流量下有效工作的微型色谱柱对“接口”要求接口不破坏MS真空系统，同时不影响色谱柱的分离柱效；接口使分离的组分尽可能多进入MS，同时让尽量少的液体流动相进入质谱；接口不改变分离后组分结构（样品不被分解损失）。液相色谱质谱联用的接口问题液相色谱质谱联用的“接口”技术发展的三个分支流动相进入质谱以后直接离子化，形成连续流动快速原子轰击技术等；流动相雾化后“去溶剂”，分析物蒸发后再离子化，形成“传送带式”接口和离子束接口等；流动相雾化后形成的小液滴去溶剂化，气相离子化或者离子蒸发后再离子化，形成热喷雾接口、大气压化学离子化和电喷雾离子化技术等。液相色谱质谱联用的接口四、液相色谱质谱联用方法建立（一）《临床色谱质谱检验技术》遗传代谢病（血氨基酸和酰基肉碱）内分泌疾病（类固醇类激素）营养素监测毒理学和滥用药物监测疼痛管理治疗药物监测（免疫抑制剂等）蛋白质鉴定和定量液相色谱质谱联用技术在临床检验领域的主要应用液相色谱质谱联用方法建立步骤样品处理方法建立色谱方法建立信息及文献检索质谱方法建立样品采集样品制备数据处理分析测定信息及文献检索项目背景、目的及临床意义目标物分析全面了解检测方法的国内外现状项目可行性评估初步的实验方案设计成本预估，以及实验所需耗材、试剂、设备等请购项目背景、目的及临床意义以高苯丙氨酸血症（HPA）的鉴别诊断为例背景：临床上一般不进行HPA鉴别诊断即治疗目的：对HPA进行鉴别诊断临床意义：可以对HPA进行针对治疗目标物分析—外源性化合物处方药药物滥用水环境外用软膏空气环境膳食补充剂目标物分析—外源性化合物目标及数量原药浓度或代谢物浓度？一种或多种？标本类型全血：化合物主要与红细胞结合（如：环孢霉素A、他克莫司）血清/血浆：化合物主要与蛋白结合（如：霉酚酸）尿液：化合物及其代谢物在尿液中含量高（如：毒品）唾液：化合物在血中以游离状态存在头发：慢性中毒目标物分析—外源性化合物采样时间以药物浓度监测为例——应随测定目的不同而异。对怀疑用量不足、疗效不好或观察疗效者一般应测定谷浓度，采血时间为早上用药前。对超量使用或怀疑出现毒副反应者一般应测定峰浓度，采血时间根据测定的药物的达峰时间进行采集。患者处于无发作也无中毒表现的稳定状态时，采血时间可为随机的，但间隔一定时间复查时应与前一次测定时采血时间相一致。监测服缓（控）释剂型者的血药浓度可在达稳态后任何时间测定，但最好测定服药前的空腹血药浓度。目标物分析—内源性化合物采样时间或周期月节律昼夜节律参考值性别年龄阶段（青春期、更年期、月经周期）采样方式坐式采集、卧式采集或其他理化性质分子量，化学结构（官能团）酸碱性溶解度其他信息测定目的？定性？定量分析方法的临床用途及认可度分析：诊断、筛查、预后？化合物在体内的代谢形式如何？是否存在同分异构体？是否有周期性变化？体内浓度范围、临床参考范围？代谢物有哪些形式？有无活性？浓度如何？存在哪些可能的干扰？化合物离体稳定性如何？保持条件特殊要求？目标物分析质谱条件质谱类型（三重四极杆、离子阱、飞行时间质谱仪？）离子化方式（ESI？APCI？）扫描方式质谱参数色谱条件液相系统（常规、超高效？）色谱柱类型（正相、反相？）流动相组成（缓冲盐？）洗脱方式（梯度、等度？）检测方法的国内外现状样品处理条件方法：衍生or非衍生？试剂盒or自配试剂？检测方法的国内外现状操作繁琐（90min）对实验室环境要求高（需严格控制氮吹干、抽风及衍生反应条件）使用盐酸正丁醇，对环境、人员有一定伤害离子化效率高可提高同分异构体检测的准确度（如C3DC和C4-OH）衍生化方法操作简单（30min）对实验室环境要求不高（仅萃取，实验条件易控制，所需设备简单）不使用盐酸正丁醇，不涉及酸腐、有害试剂离子化效率受影响，仪器灵敏度要求高对同分异构体检测准确度相对低非衍生化方法样品处理条件样本量样本类型新鲜尿液？尿滤纸片？抗凝？非抗凝？检测方法的国内外现状样本类型影响PeiyuanYin,AndreasPeter,etal.ClinicalChemistry,2013,59(5):833–845检测方法的国内外现状其他—采血管塑料材质可能影响某些物质的浓度和稳定性；添加剂或塑料溶出的小分子或会造成干扰（干扰峰、浓度变化、基线抬高）其他—试剂、消耗品试剂：尽量选用质谱级试剂；使用去离子水或更高纯度的水；消耗品：如96孔板，PCR膜、离心管。不同厂家的消耗品由于工艺和原材料的差异，可能会带来不同的干扰，方法开发前应尽量多准备几个品牌的同类耗材供考察；检测方法的国内外现状消耗品—96孔板DonaldH.Chace,ZuzhengLuo,etal.ClinicaChimicaActa411(2010)1284–1286聚苯乙烯聚丙烯技术可行性讨论难点、待解决的问题（如前处理、标本采集运输、干扰等）社会可行性分析项目对社会的影响，包括法规、政策等实验环境和样品准备样本稳定性、实验条件—温湿度