临床微生物学检验：实验6

临床微生物检验实验六实验目的问题22掌握抗菌药物敏感试验的原理、操作方法、结果判读及其影响因素1掌握抗酸染色法的原理、操作方法及其注意事项3掌握镀银染色及TPPA、TRUST试验原理、方法、结果判断和临床意义第1天实验内容1个MH平板/人药敏纸片选择：金黄色葡萄球菌：PG、OX、VA、CLI、CIP、GEN

铜绿假单胞菌：CAZ、GEN、PIP、CIP、IMPAK

1.药敏试验

2.抗酸染色什么是CLSI?什么是ATCC?美国临床实验室标准化协会

ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute美国典型培养物（标准菌种）收藏所

AmericanTypeCultureCollection

掌握：纸片扩散法（K-B法）原理操作方法、结果判读和影响因素熟悉：纸片扩散法的质量控制主要试剂和器材菌种：金葡或铜绿MH培养基、0.5麦氏比浊管（比浊仪）无菌生理盐水、各种药物纸片等K-B药敏法敏感试验将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系纸片扩散法（K-B法）原理

耐药中介敏感RISLog2.MICd1d2抑菌圈直径（mm)vMIC与抑菌圈直径的线性关系纸片扩散法材料与判断抗菌药物纸片：直径6.0--6.35mm，吸水量为

20μl的滤纸。培养基：MH琼脂，pH7.2--7.4，琼脂厚度4mm菌液浓度和接种：0.5麦氏浊度，15min内接种完毕。结果判断与报告：S（敏感）、I（中介）、

R（耐药）质控：采用标准菌株进行药敏质控。2023/3/99质量控制：采用质控菌株

肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922ATCC35218

铜绿假单胞菌：大肠埃希菌ATCC25922ATCC35218

铜绿假单胞菌ATCC27853

不动杆菌等：大肠埃希菌ATCC25922ATCC35218

铜绿假单胞菌ATCC27853

葡萄球菌属：金黄色葡萄球菌ATCC25923

大肠埃希菌ATCC35218

肠球菌属：粪肠球菌ATCC29212

纸片扩散法纸片扩散法的步骤水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，制备成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板；挑取孵育16～24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。

纸片扩散法的步骤用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度；最后沿平板内缘涂抹1周；平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm。纸片扩散法的步骤35℃孵育16～24小时量取抑菌圈直径；根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。药物敏感试验操作示意图①②③④⑤⑥>24>15●纸片及培养基要放置室温平衡;●菌液浓度要准确;●平板涂布要均匀;●各抗菌纸片中心距离应大于24mm;●纸片中心距平板内缘应大于15mm;●纸片贴上后，不能移动。注意事项影响因素培养基的质量药敏纸片的质量菌液的浓度、纯度、接种菌量孵育的温度和观察时间操作质量，等

分枝杆菌与抗酸染色卡介苗、抗酸染色液、玻片，等1.掌握抗酸染色的原理、方法和结果判断。2.掌握结核分枝杆菌的形态。目的要求试剂和器材细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸，一般不易着色，如果经加温或延长染色时间而着色，一旦着色，能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱色，所以又称抗酸杆菌。

抗酸染色原理涂片、干燥、紫外杀菌、固定1.初染：石炭酸复红溶液

加热至冒白烟5min2.媒染：

3%盐酸酒精溶液3min3.复染：碱性美蓝溶液1min结果观察结核分枝杆菌的形态抗酸染色阳性蓝色背景下菌体红色。菌体细长略弯曲有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列。结核杆菌（抗酸染色）结核杆菌（抗酸染色）结核杆菌（抗酸染色）结核杆菌（抗酸染色）

培养基（L-J培养基=罗氏培养基）培养条件（专性需氧、较长时间）菌落特征固体培养基---典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或淡黄色，形似菜花样。结核分枝杆菌的分离培养菜花样菌落结核杆菌（L-J培养基）课后小结药敏结果的判断及CLSI标准抗酸染色的注意事项：加热报告方式：萋尼氏染色镜检结果分级报告标准抗酸杆菌阴性(－)：连续观察300个油镜视野未发现抗酸杆菌。报告抗酸杆菌菌数：1～9条/300视野。抗酸杆菌阳性（1＋）：1～9条/100视野。抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野 抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野1.K-B法药敏试验结果分析琼脂稀释法药敏试验（1份/组）1.配制不同浓度抗菌药物2.配制含不同浓度抗菌药物的MH平板（共11个平板）3.点种金葡菌及铜绿于以上MH平板中第二天实验内容用刻度尺量取抑菌环直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。根据CLSI标准:敏感(susceptible,S)耐药(resistant,R)中介(intermediate,I)药敏结果判断抑菌圈直径的测量抗菌药物纸片含药量抑菌环直径(mm)RIS青霉素10U≤28-≥29苯唑西林1ug≤1011-12≥13万古霉素30ug--≥15庆大霉素10ug≤1213-14≥15环丙沙星5ug≤1516-20≥21克林霉素2ug≤1415-20≥21金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性评价抗菌药物纸片含药量抑菌环直径(mm)RIS哌拉西林100ug≤17-≥18头孢他啶30ug≤1415-17≥18亚胺培南10ug≤1314-15≥16庆大霉素10ug≤1213-14≥15环丙沙星5ug≤1516-20≥21阿米卡星30ug≤1415-16≥17铜绿假单胞菌抗菌药物敏感性评价葡萄球菌药敏结果解释原理：将药物混匀与琼脂培养基中，配制含不同浓度的药物平板，使用多点接种器接种细菌，孵育后观察细菌生长情况，抑制细菌生长的琼脂平板所含的最低药物浓度为MIC(minimalinhibitoryconcentration,MIC)一、目的要求（1）熟悉琼脂稀释法测定抗生素敏感性的原理、操作方法、结果判读和临床意义。（2）了解稀释法质量控制二、主要器材试剂

1.菌种：金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌

2.培养基：MH琼脂

3.器材试剂：无菌NS、无菌蒸馏水、0.5麦氏比浊管、加样器琼脂稀释法药敏试验

原理：将不同浓度的抗菌药物分别混匀于琼脂培养基中，配制成含不同递减浓度药物的平板并接种待检菌，孵育后观察细菌在含不同浓度药物的平板上的生长情况，以无细菌生长平板的最低药物浓度为待检菌的MIC。琼脂稀释法药敏试验含药琼脂的制备：（1）稀释抗菌药物：（倍比稀释法）配制浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1280ug/ml的共11种不同浓度的药液。（2）分别取上述药液2ml加入内径为9cm的标记平板内。（3）再取融化后已冷至50℃左右的MH琼脂18ml加进平板内，边加加摇晃平板，使药物和培养基充分混匀。另配制一块不含药物的平板（仅含20mlMH琼脂）。测试菌的准备：用NS校正浓度到0.5麦氏比浊标准，再用NS

稀释10倍(100μl菌液+900μlNS)，使含菌量达到107CFU/ml。接种：在平板上划定区域后用移液器进行接种，接种菌量为

1--2ul，每个接种点含104—2×104个菌。孵育：待接种点菌液干后，置35℃18-24小时结果判断：完全抑制菌落生长的最低药物浓度为该菌对检测菌的MIC。影响因素倍比稀释法母液12345678910111280640320160

8040201052.51.25

25603ml弃去1、往11个试管中加入3ml无菌生理盐水3ml2、往第一个试管加入3ml2560ug/ml的CIP母液。振荡混匀后，从第一个试管吸取3ml到第二个试管，振荡混匀。3、从第二个试管吸取3ml到第三个试管，振荡混匀，如此顺推，得到从1280到1.25ug/ml共11支不同浓度CIP溶液。

本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。如果出现低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。2023/3/94444

药物浓度

4 8 163264ug/ml制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104CFU/每个点，孵育，判读结果琼脂稀释法1.琼脂稀释法结果观察2.Fontana镀银染色法3.TRUST试验和TPPA试验

TPPA:血清标本：每人做；

阳性质控品：每组做1份

TRUST:血清标本

阴阳性质控品：每人做第三天实验内容

将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。如果出现低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。1.

涂片干燥：

在载玻片中央滴加生理盐水一滴，用牙签取自己的牙垢少许与生理盐水混匀做涂片，干燥2.固定：滴加固定液，固定1分钟后，水洗。3.媒染：滴加媒染液，加热至冒蒸汽状态维持30S，水洗。3.银染：滴加硝酸银染液，微加温，染色约30S，水洗，自然干燥后镜检。

Fontana镀银染色法

Fontana镀银染色（1）固定液：冰醋酸1ml，甲醛2ml，蒸馏水100ml。（2）媒染液：鞣酸5g，石炭酸1g，蒸馏水100ml。（3）硝酸银溶液：硝酸银5g，蒸馏水100ml。（4）用前取银溶液20ml，逐滴加入100g/L氢氧化铵，至产生棕色沉淀，轻摇后溶解，微呈乳白色。结果观察螺旋体染成棕褐色/黑褐色。将梅毒螺旋体Nichols株的菌体成分包被在人工载体明胶粒子上致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体抗体结合发生凝集反应，检测样品中的梅毒螺旋体抗体。用于梅毒初筛试验阳性标本的确证试验灵敏度高、特异性高螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（TPPA）原理明胶颗粒凝集试验反应原理加样品稀释液：第1孔至第8孔…8加25ul待检样本到第1孔…8稀释样品：第1孔至第8孔…8加入未致敏颗粒到第3孔,加入致敏颗粒从第4孔至第8孔………8加样品稀释液：第1孔至第8孔…8加25ul待检样本到第1孔…8稀释样品：第1孔至第8孔…8加入未致敏颗粒到第3孔,加入致敏颗粒从第4孔至第8孔………85.混匀，加盖，静置孵育2小时5.混匀，加盖，静置孵育2小时6.结果观察阳性：出现明胶颗粒凝集（++以上）阴性：不出现凝集

－±＋＋＋

１２３４５６７８最终稀释倍数1:401:801:1601:3201:6401:1280-

粒子成纽扣状聚集,呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形-/+

粒子形成小环状,呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形+

粒子环形明显变大,其外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围

++

产生均一的凝集,凝集粒子在底部整体上呈膜状延展++注意事项所有的样品、试剂及对照品均应作为感染性物