基因操作及其医学应用2讲义

基因操作及其医学应用2讲义第1页/共38页转基因和基因治疗第2页/共38页

转基因和基因治疗

1．概念和研究现状

2．基因治疗的基本类型

3．转基因的基本方法

4.转基因的表达和调控

5．基因治疗的运用和前景内容提纲第3页/共38页

基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。转基因及基因治疗基本概念第4页/共38页转基因及基因治疗基因治疗的程序目的基因转基因基因表达基因治疗viralnonviralInvivoexvivo体内调控第5页/共38页基因治疗的基本类型

★细胞介导的基因治疗(exVivo)是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)。第6页/共38页★体外表达基因治疗(inVitro)

是传统的基因表达形式。第7页/共38页转基因的基本方法

非病毒法(Nonviral)病毒法(Viral)和第8页/共38页1、病毒法(Viral)

1)逆转录病毒(Restrovirus)RNA病毒，结构缺陷

PackagingCell转基因及基因治疗转基因的基本方法第9页/共38页第10页/共38页

★体内直接转基因治疗（inVivo）转基因及基因治疗基因治疗的基本类型

是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率低。第11页/共38页优势：

①整合率高;

②对外源DNA影响小;

③单拷贝整合，利于表达调控；

④安全。转基因及基因治疗转基因的基本方法第12页/共38页劣势：

①容量小;

②只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因;

③Transiteexpression;

④R.V.+P.C+P.C实验室要求高。转基因及基因治疗转基因的基本方法第13页/共38页

2）腺病毒(Adenovirus)

腺相关病毒(Adenoassociatedvirus)DNA病毒

E1和E3基因缺乏

263细胞系生长转基因及基因治疗转基因的基本方法第14页/共38页特点：

①能感染静止细胞，体内(invivo)转基因

②对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗

③包容量大

④尚无PackagingCell，欠安全

⑤有较强免疫原性，易引起体内免疫反应转基因及基因治疗转基因的基本方法第15页/共38页2、非病毒法(Nonviral)

1）显微注射法(Microinjection)2)

基因定位整合技术(Genetargeting)3)

受体介导(Receptor-mediatedmethods)

4)

组织内直接注射(DirectinjectionofDNA)

5)

磷酸钙沉淀法(CaPO4precipitation)转基因及基因治疗转基因的基本方法第16页/共38页基因定位整合技术

（基因打靶GeneTargeting)基因打靶的概念通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（geneknockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（geneknockin）。第17页/共38页基因打靶的必要条件打靶载体打靶载体中的必要成分：载体DNA

目的基因同源片段筛选标志基因

neu（新霉素）阳性筛选标志基因；

HSV-tk阴性筛选标志基因。胚胎干细胞第18页/共38页基因敲除的基本程序

1、构建打靶载体

A.获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；

B.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；第19页/共38页C.将neu基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源序列的中间；

D.在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。第20页/共38页2、打靶载体导入ES细胞3、基因敲除ES细胞注射入胚泡4、胚泡植入假孕的小鼠子宫中5、嵌合体的杂交育种第21页/共38页

附

表

外源DNA的整合

转基因及基因治疗转基因的基本方法第22页/共38页Table1.Methodsofdeliveringgenesintomammaliancellsandlikelyapplicationsingenetherapy(+).Majorapplication:(+/-),someapplication;(-).Littleornoapplication;T.onlytransientexpression;S.stableexpressionScience,Vol.260:14May,1993第23页/共38页1.启动子(promoter)

选用或设计适当地强启动子能使外源性基因在宿主体内高效表达。

2．内含子(intron)

在转基因过程中，内含子可增强基因表达。转基因及基因治疗转基因的表达和调控第24页/共38页3．反式作用因子(Trans-activator)

能激活不同种外源基因转录，提高转录基因的表达效率。

4．载体(Vector)

要考虑病毒载体与外源基因之间的相互干扰，必要时切除载体上无关序列，以决定病毒载体与目的基因的最佳组合，使其表达达到最佳效率。转基因及基因治疗转基因的表达和调控第25页/共38页1、肿瘤的基因治疗

1)肿瘤的免疫基因治疗．

★载体细胞靶向表达细胞因子载体细胞:肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)

淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs)

细胞因子:IL-1,2,4,6,7,IFNs，TNF-α,CSF。★肿瘤疫苗:改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强烈免疫反应转基因及基因治疗基因治疗的应用第26页/共38页2)反义技术抑制肿瘤基因功能人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)互补寡核苷酸，“封闭”癌基因的转录或翻译。转基因及基因治疗基因治疗的应用第27页/共38页3)病毒导向酶解药物前体疗法(VDEPT)---“自杀基因”(Suicidegene)

该基因编码的酶能活化无毒药物前体杀伤该酶所在的细胞。将“自杀基因”转染肿瘤细胞，使用对正常细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。转基因及基因治疗基因治疗的应用第28页/共38页转基因及基因治疗基因治疗的应用(肝癌细胞）单纯疱疹胸苷激酶(HSV-Tk)甲氧嘌呤阿拉伯糖苷AM(D.T)

阿拉伯糖苷酸杀伤肝癌细胞（无毒前体）活化第29页/共38页2．传染病基因治疗

1）刺激更强的机体抗HIV免疫反应转基因及基因治疗基因治疗的应用(HIV患者)成纤维细胞HIVpM160gp160诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤HIV感染细胞R.V.表达第30页/共38页2）干扰病毒复制转基因及基因治疗基因治疗的应用★核酸(Ribozyme):Ribozymegene→HIV患者CD4→

破环基因完整性★反义药物GEM-91:25bps反义寡核苷酸HIVgag蛋白mRNA

抑制HIV复制封闭第31页/共38页转基因及基因治疗3）其它传染病基因治疗：

HBV

流感病毒单纯疱疹病毒流行性出血热水泡性口炎病毒基因治疗的应用第32页/共38页3．遗传病的基因治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症(ADA)(欧盟、美国)

囊纤维变性(CF)(美国、英国)

人家族性高胆固醇血症(FH)(美国)

血友病B-IX因子成纤维细胞表达(中国)

地中海贫血(中国)转基因及基因治疗基因治疗的应用第33页/共38页转基因及基因治疗基因治疗的应用

4．神经系统疾病的基因治疗*这些遗传病能造成神经系统损伤

第34页/共38页转基因及基因治疗基因治疗的应用

5．心血管系统疾病的基因治疗第35页/共3