抗原抗体反应的类型之酶免疫技术（免疫学检验技术课件）

BAS-ELISA免疫学检验技术教学培训课件—*—BAS-ELISA生物素（B）又称维生素H或辅酶R，可从卵黄和肝脏中提取，对其结构上的羧基进行改造，成为活性基团，成为活化生物素，后者可以和各种蛋白质（如抗体、SPA、酶、激素）、多肽、多糖、核酸及放射性核素、荧光素、胶体金等结合。这些物质与活化生物素结合称为生物素化。—*—BAS-ELISA亲和素（A）又称抗生物素蛋白，常用的有两种【卵白亲和素（A）+链霉亲和素（SA）】。均是由4个相同亚基组成，能结合4个生物素分子，亲和素与生物素之间的亲和力极强，比Ag与Ab的亲和力至少高一万倍，且具有高度特异性和稳定性。—*—BAS-ELISA不同组分绘图BABBBBAEBBBEEBEAEBAEBBBEEEBBBEAAEBBEBAEBBB—*—BAS-ELISAB-A标记技术在ELISA中的技术类型（1）BA-ELISA（直接法/间接法）（2）BAB-ELISA（直接法/间接法）（3）ABC-ELISA（直接法/间接法）—*—BAS-ELISABA-ELISABA-ELISA（直接法）BA-ELISA（间接法）BAEBAE—*—BAS-ELISABAB-ELISABAB-ELISA（直接法）BAB-ELISA（间接法）BAEBBBEEBAEBBBEE—*—BAS-ELISAABC-ELISAABC-ELISA（间接法）BAEBBBEEEBBBEAAEBBEBABBB酶标记物的制备和载体免疫学检验技术教学培训课件—*—提问酶标记物的制备和载体什么样的酶最适合做酶标？1）活性高，纯度高2）专一性强3）性质稳定，易与Ag或Ab偶联4）测定方法简便易行、敏感、精确5）酶和底物对人体无害、价廉易得—*—酶标记物的制备和载体常用的酶及底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）及底物1）来源：植物辣根（可食用→安全、价廉、易得）2）结构：糖蛋白（主酶：与酶活性无关，275nm有吸收峰）+亚铁血红素（辅酶：发挥酶活性，403nm有吸收峰）—*—酶标记物的制备和载体常用的酶及底物3）质量评价指标：纯度值（RZ）+活性纯度值：λ403nm/λ275nm，高纯度HRP，RZ＞3.0。活性：1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。4）特点：HRP性质稳定、容易保存、易于提取等（ELISA中应用最多）—*—酶标记物的制备和载体常用的酶及底物5）催化反应DH22H20+H2O2D+HRPDH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体。—*—酶标记物的制备和载体常用的酶及底物6）底物：邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）等。OPD：不稳定，有致癌性。OPD2H20+H2O2橙黄色+HRPH2SO4棕黄色（492nm）—*—酶标记物的制备和载体常用的酶及底物TMB：稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。TMB2H20+H2O2蓝色+HRPH2SO4黄色（450nm）—*—酶标记物的制备和载体常用的酶及底物（2）碱性磷酸酶（AP）及底物1）来源：大肠杆菌、小牛肠黏膜2）特点：稳定性差、难纯化3）底物：对-硝基苯磷酸酯（p-NPP）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）对硝基酚（黄色）APNaOH黄色（405nm）—*—酶标记物的制备和载体酶标抗体（抗原）的制备（以将HRP标记到Ab上为例）—*—酶标记物的制备和载体（1）改良过碘酸钠法过碘酸钠将羟基氧化为醛基，-CHO和-NH2，两者可形成-CH2-NH-。封闭酶上-NH2：二硝基氟苯；释放酶上-NH2：硼氢化钠酶标抗体（抗原）的制备（以将HRP标记在Ab上为例）动画：改良过碘酸钠法制备酶标抗体—*—酶标记物的制备和载体（2）戊二醛交联法戊二醛的两个醛基分别与HRP和Ab上的氨基结合。酶标抗体（抗原）的制备（以将HRP标记到Ab上为例）—*—酶标记物的制备和载体5种标记产物1）酶-抗体2）酶-酶3）抗体-抗体4）游离酶（增加非特异性显色）5）游离抗体（降低非特异性显色）酶标抗体的纯化—*—酶标记物的制备和载体方法：层析、饱和硫酸铵沉淀法等酶标抗体的纯化微课：酶标记物的制备（YY的奇遇3）—*—酶标记物的制备和载体1）活性鉴定：双扩等2）酶标记率的测定：分光光度法测定酶标记物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，E/P一般为1-2。酶标抗体的鉴定—*—提问酶标记物的制备和载体假设已得到纯化的酶标抗体，此抗体的抗原是一种可溶性抗原，请问可以用何种方法鉴定此抗体是否失去与抗原结合的免疫活性？怎么鉴定酶的活性是否存在？出现沉淀线沉淀线显色—*—提问酶标记物的制备和载体固相载体的要求有哪些？1）结合抗体或抗原的容量大；2）与抗原或抗体结合稳定且不易脱落；3）不影响所固定的抗体或抗原的活性；4）固化方法应简便、快速。—*—酶标记物的制备和载体固相载体（1）塑料制品聚苯乙烯或聚氯乙烯→微量反应板（96孔）、小试管和小珠。（2）微粒（μm/nm）磁珠（3）膜载体硝酸纤维素膜（NC）/玻璃纤维素膜酶联免疫吸附试验免疫学检验技术教学培训课件—*—酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体（4种）双抗原夹心法间接法竞争法测HBcAb捕获法EEE—*—酶联免疫吸附试验间接法（测抗体最常用）1）包被抗原2）加适当稀释的待测标本，温育、洗涤3）加酶标二抗，温育、洗涤4）加底物显色固相抗原标本（含抗体）酶标二抗EE底物E—*—酶联免疫吸附试验间接法注意点注意点：可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，只要求一抗是同类即可。动画：间接法测抗体的操作步骤—*—提问酶联免疫吸附试验现分别检测一份血清中是否有针对大肠杆菌和伤寒杆菌的IgG类抗体，能否用同一瓶酶标抗IgG抗体（酶标二抗）？—*—提问酶联免疫吸附试验现分别检测一份血清中是否有针对大肠杆菌和伤寒杆菌的IgG类抗体，能否用同一瓶酶标抗IgG抗体（酶标二抗）？—*—提问酶联免疫吸附试验双抗原夹心法：1）怎么绘制双抗原夹心法的原理模式图？2）请说出双抗原夹心法的操作步骤？3）怎么判断结果？4）能否将两步合成一步？5）是否容易出现钩状效应导致的假阴性结果？—*—酶联免疫吸附试验双抗原夹心法1）包被抗原2）加待测标本，温育、洗涤3）加酶标抗原，温育、洗涤4）加底物显色显色→阳性；不显色→阴性（载体-Ag-Ab-Ag*E）E动画：双抗原夹心法测抗体的操作步骤—*—酶联免疫吸附试验1）乙肝表面抗原（HBsAg）2）乙肝表面抗体（HBsAb）/（抗-HBs）3）乙肝e抗原（HBeAg）4）乙肝e抗体（HBeAb）/（抗-HBe）5）乙肝核心抗体（HBcAb）/（抗-HBc）乙肝两对半—*—酶联免疫吸附试验竞争法测HBcAb1）包被HBcAg（目标）2）加待测标本（甲）和酶标抗体（乙），温育、洗涤3）加底物显色。（载体-Ag-Ab/Ab*E）E底物固相抗原标本（含抗体）酶标抗体E—*—酶联免疫吸附试验结果判断：显色→阴性；不显色→阳性（显色深浅与待检抗原成反比）动画：竞争法测乙肝核心抗体（HBcAb）的操作步骤竞争法测HBcAb—*—酶联免疫吸附试验竞争法测HBeAb1）包被HBeAb（甲）2）加待测标本（乙）和HBeAg（目标），温育、洗涤3）加酶标HBeAb（丙），温育、洗涤4）加底物显色。（载体-Ab-Ag-Ab/Ab*E）底物固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体EE—*—酶联免疫吸附试验结果判断：显色→阴性；不显色→阳性（显色深浅与待检抗原成反比）视频：乙型肝炎病毒e抗体检测（ELISA法）动画：竞争法测乙肝e抗体（HBeAb）的操作步骤竞争法测HBeAb—*—设计情景提问酶联免疫吸附试验今收到血清一份，半个月前患者尿道少量感染大肠杆菌（血清中有针对大肠杆菌IgM抗体），今该患者疑似患伤寒，申请检查血清中是否有抗伤寒杆菌的IgM类抗体，请用捕获法完成检测，为了降低抗大肠杆菌IgM的干扰，可以采取什么措施？—*—酶联免疫吸附试验捕获法测IgM1）包被抗人IgM抗体2）加入待测稀释血清，捕获血清中所有的IgM，温育、洗涤3）加入特异性Ag，温育、洗涤4）加入针对特异性Ag的酶标抗体，温育、洗涤5）显色，定性、定量特异性IgM结果判断：显色→阳性；不显色→阴性E（载体-抗人IgM-IgM-特异性Ag-Ab*E）—*—酶联免疫吸附试验捕获法测IgM注意点1）急性感染的早期诊断2）最常用的IgM抗体检测方法3）RF（IgM类）可致假阳性结果4）适当稀释以减少标本中非特异性IgM的干扰—*—酶联免疫吸附试验ELISA关键技术1）包被：将抗原或抗体固定在固相载体上的过程。方法：抗体或蛋白质类抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，加入ELISA板孔中，在4-8℃冰箱中过夜或37℃中保温2h。—*—酶联免疫吸附试验ELISA关键技术2）封闭：用于包被的抗原抗体浓度低，吸收后固相表面尚有未被占据的空隙，让大量不相关蛋白质填充这些空隙的过程。封闭剂：1%-5%牛血清白蛋白/10%小牛血清。—*—酶联免疫吸附试验ELISA注意事项1）加样定性：滴加液体时每滴液体体积基本相同。定量：加样量力求准确：加在孔底，避免气泡和溅出。移液器—*—酶联免疫吸附试验ELISA注意事项2）温育时间：按说明书要求。温育容器：水浴箱（内置湿盒）、恒温箱。注意点：勿叠放，避免“边缘效应”。水浴箱—*—酶联免疫吸附试验ELISA注意事项3）洗涤目的：洗掉非特异性吸附。方法：手工洗板；洗板机洗板（多洗一次）。4）显色时间：按试剂盒要求。手工洗板洗板机洗板酶联免疫吸附试验免疫学检验技术教学培训课件—*—酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理将已知抗体（抗原）吸附在固相载体表面以后，抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法使固相上形成的抗原抗体复合物与其它物质分离，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。基本过程：包被→加样→洗涤→显色—*—酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原（3种）双抗体夹心法双位点一步法竞争法测抗原EE—*—酶联免疫吸附试验双抗体夹心法（测抗原最常用）1）包被抗体、洗涤2）加待测标本，温育、洗涤3）加酶标抗体，温育、洗涤4）加底物显色固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物E双抗体夹心法（测抗原最常用）—*—酶联免疫吸附试验结果判断：显色→阳性；不显色→阴性（显色强弱与待测抗原成正比）E（载体-Ab-Ag-Ab*E）视频：乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA法）动画：双抗体夹心法测抗原的操作步骤—*—酶联免疫吸附试验双抗体夹心法注意点注意点：RF可引起假阳性结果。固相抗体标本（含RF）酶标抗体EE底物E—*—酶联免疫吸附试验双位点一步法将固相抗体和酶标抗体换为针对抗原分子上两个不同表位的两种McAb。测定时将含待测抗原标本与酶标抗体同时加入进行结合反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，加入底物进行显色测定。—*—酶联免疫吸附试验双位点一步法EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体（载体-Ab-Ag-Ab'*E）—*—酶联免疫吸附试验双位点一步法注意点注意点：避免“钩状效应”（抗原过量）导致假阴性。EE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体动画：双位点一步法测抗原的操作步骤—*—酶联免疫吸附试验竞争法测抗原1）包被抗体（目标）2）加待测抗原（甲）和酶标抗原（乙），温育、洗涤3）加底物显色。（载体-Ab-Ag/Ag*E）EE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗原—*—酶联免疫吸附试验结果判断：显色→阴性；不显色→阳性（显色深浅与待检抗原成反比）竞争法测抗原动画：竞争法测抗原的操作步骤酶免疫技术免疫学检验技术教学培训课件—*—酶免疫技术概述酶免疫技术概念以酶标记的Ag或Ab作为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原，将Ag和Ab反应的特异性与酶催化底物的放大作用和高敏感性相结合的一种免疫检测技术。酶标抗原（Ag*E）酶标抗体（Ab*E）EE—*—酶免疫技术概述双抗体夹心法检测血清中HBsAg微课：酶免疫技术的概念和分类酶标抗体固相抗体待测抗原（HBsAg）底物EE载体包被抗体→洗涤→加待测血清→洗涤→加酶标抗体→洗涤→加底物显色（定性+定量）—*—酶免疫技术概述酶免疫技术分类酶免疫测定：对液体标本中的抗原或抗体进行定性和定量分析。酶免疫组织化学技术：对组织切片或其他标本中的抗原进行定位分析。—*—提问酶免疫技术概述在双抗体夹心法检测血清中HBsAg的试验中，标本是液体标本还是组织切片？可不可以定性和定量？属于酶免疫测定还是酶免疫组织化学技术？答案：液体标本；可定性和定量；属于酶免疫测定。—*—设计情景提问酶免疫技术概述假如在鸡的肝细胞内有一种蛋白叫A蛋白，可是不知道它是在细胞膜上？细胞浆里？还是细胞核里，怎么定位？动画：酶免疫组织化学技术对抗原进行定位—*—酶免疫技术概述酶免疫测定分类均相酶免疫测定：不需要将游离和结合的酶标记物分离。非均相酶免疫测定：需要将游离和结合的酶标记物分离。—*—提问酶免疫技术概述在双抗体夹心法检测血清中HBsAg的试验中，未反应完的游离酶标抗体和结合酶标抗体在检测时是否进行了分离？属于均相酶免疫测定还是非均相酶免疫测定？答案：通过洗涤分离；非均相酶免疫测定。—*—酶免疫技术概述酶免疫测定分类液相酶免疫测定：使用分离剂，将液相中游离的和结合的标记物分开，测定结合状态的酶标记物活性。固相酶免疫测定：通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上，用洗涤的方法将游离的酶标记物去除，测定结合状态的酶标记物活性。最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）—*—提问酶免疫技术概述在双抗体夹心法检测血清中HBsAg的试验中，是否有固相载体参与连接？属于液相酶免疫测定还是固相酶免疫测定？答案：有载体；固相酶免疫测定。—*—酶免疫技术概述酶免疫技术分类总结酶免疫技术酶免疫组织化学技术（固）酶免疫测定（液）均相酶免疫测定非均相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定ELISA（最常用）（定位）（定性、定量）（不分离）（分离）其他酶免疫技术免疫学检验技术教学培训课件—*—设计情景提问其他酶免疫技术今收到血清标本一份，要一次性测出其中是否含有针对Ag1-Ag5相应的5种IgG类抗体（判断阴阳性）。现有：已知的5种纯化抗原（Ag1-Ag5），分别装在5个瓶子里；一瓶针对IgG的酶标二抗；一长条硝酸纤维素膜（NC），怎样操作能做出结果？微课：斑点酶免疫吸附试验（“画点”）—*—其