动物细胞制药的培养需求

基因工程动物细胞培养制药工艺

药用蛋白质合成复杂，要有准确折叠空间结构，要有糖基化，才能使药品发挥真正功效。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功效修饰。动物细胞培养技术来生产有功效蛋白质，大规模动物细胞尤其是人源细胞培养在药品生产中位置会越来越主要。人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。动物细胞制药的培养需求第1页第一节动物细胞制药表示系统与特征

昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、主要表示活性外源蛋白有效系统，应用于药品蛋白质表示。

一、哺乳动物细胞表示系统与特征1.动物细胞特征细胞膜、细胞质和细胞核没有细胞壁。亚细胞器，功效独特。动物细胞制药的培养需求第2页2.动物细胞代谢动物细胞不一样代谢路径及其对应酶体系定位于特定亚细胞区域。经过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间物质、信息和能量流动，经过穿梭实现不一样代谢路径之间交换。在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢前体，所以动物细胞培养含有一定灵活性。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺消耗得以赔偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其它氨基酸消耗得以赔偿。动物细胞制药的培养需求第3页糖代谢特点：动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，深入被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊糖磷酸路径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其它中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量乳酸，对细胞产生毒性。

动物细胞制药的培养需求第4页氨基酸代谢特点：吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢路径，经过脱氨、转氨等作用，合成其它必需和非必需氨基酸。大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺经过转氨生成其它嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢前体。谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中含有主要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长动物细胞培养体系，转氨作用是主要代谢路径。

动物细胞制药的培养需求第5页不一样培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重合于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸起源于谷氨酰胺。在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH形式提供，起源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢路径贡献和所起作用不一样。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，防止有毒废物积累。

动物细胞制药的培养需求第6页3.蛋白质糖基化蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白质糖基化无需模板指导，所以糖蛋白寡糖结构轻易发生改变。糖蛋白单糖单元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-岩藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化位点和数量及糖种类都不一样。动物细胞制药的培养需求第7页N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺氨基上，其模体保守序列为Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸以外任意氨基酸)。假如X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同关键是3个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺组成5糖（Man3GluNAc2），其它糖形成支链。高甘露糖型支链为甘露聚糖（5～9聚体），无其它糖。复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。杂合型最少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。动物细胞制药的培养需求第8页O-聚糖连接在Thr/Ser羟基上，还没有发觉保守序列。O-聚糖有四种不一样关键结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质局部构象。O-糖基化比较小，普通为1～6个寡聚糖，但比N-糖基化改变更大。O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。动物细胞制药的培养需求第9页糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定相互作用，都含有相同关键结构：胆胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。胆胺形成膜内蛋白桥，而肌醇在膜内。在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割这类蛋白，有利于纯化。动物细胞制药的培养需求第10页细胞特异性糖基化路径——淋巴细胞中进行，它不依赖于内质网和高尔基体。IgG糖基化，等分GlcNAc残基连接在关键甘露糖上，该糖基化在抗体依赖性细胞介导细胞毒性中起主要作用。IgG蛋白铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖基化。促黄体激素、促甲状腺素等硫酸化只能在垂体中发生。动物细胞制药的培养需求第11页尽管哺乳动物细胞含有细胞内糖基化装置，但不一样细胞系，糖基化特征不一样。鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产抗体中，乙酰果糖占优势。CHO细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。要依据糖基化结构，选择适宜细胞系。

动物细胞制药的培养需求第12页细胞系FucGal唾液酸α1,6α1,3Fucα1,3GalSO4-GalNAcα2,3

α2,6糖基化等分GluNAcBHK++0+0++0-0CHO++-00++0+0鼠杂交瘤++0++0++0+++0C127++0+++++++++++0J558L++0++-+++++++0人淋巴细胞++000++0++人垂体++00+++++0++Namalwa++000++++--人鼠杂交瘤++000+++0动物细胞制药的培养需求第13页2.哺乳动物细胞表示系统基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力无限生长细胞系，即永久性细胞。表示蛋白质能正确加工、修饰并折叠形成含有生物活性功效分子，靠近或类似天然产物。糖基化等修饰是糖蛋白行使功效所必需，而且对产品质量有影响，如生物活性、稳定性、免疫原性等。原核细胞表示EPO无糖基化，在体内表现无活性。原核表示GM－CSF虽有活性，但在体内产生抗体。动物细胞表示产物分泌到培养液，轻易分离纯化。约有70％同意蛋白质药品由哺乳动物细胞系统表示制造，而且数目还在不停增加。动物细胞制药的培养需求第14页表示系统O-糖基化寡聚甘露糖高甘露糖复合体大肠杆菌0000酿酒酵母＋＋0＋＋＋＋－昆虫Sf9＋＋＋＋＋＋0－仓鼠CHO＋＋＋＋0＋＋仓鼠BHK＋＋＋＋0＋＋鼠杂交瘤＋＋＋＋0＋＋鼠骨髓瘤＋＋＋＋0＋＋C127＋＋＋＋0＋＋J558L＋＋－0＋＋人淋巴细胞＋＋00＋Namalwa＋＋＋＋0＋＋人鼠杂交瘤－＋＋0＋＋动物细胞制药的培养需求第15页

大肠杆菌酵母哺乳动物细胞产物浓度高高低分子量低高高二硫键有限不受限制不受限制分泌无有或无有形式包涵体单链，天然单链，天然折叠不正确正确正确糖基化无可能完全逆转录病毒无无可能热原可能无无培养特点轻易轻易较难，成本高分离纯化复杂复杂简单动物细胞制药的培养需求第16页细胞类型表示水平（μg/ml）猴CV11～10猴CV10.05猴COS1小鼠成纤维细胞C1271～5小鼠成纤维细胞3T30.1～0.5CHO（dhfr－）0.01~0.05CHO（dhfr－）10动物细胞制药的培养需求第17页动物细胞表示系统不足是细胞生长迟缓，生产效率较低，产量远远落后于其它表示系统。骨髓细胞MPG－11生产IgG能力为5pg/(细胞.分钟)，10L反应器，密度为107/ml，生产能力不到1g/d。连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时造成了副产物增加。动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。培养基要求高，需要添加氨基酸、维生素等，往往需要附加血清，提供生长因子，费用较高。同时可能有潜在致病因子、免疫原性存在。表示载体改进和宿主细胞改造是动物细胞表示系统研发主要内容。动物细胞制药的培养需求第18页3.昆虫细胞表示系统与特征表示载体为昆虫病毒，转染昆虫细胞，表示出目标蛋白质。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。苜蓿尺蠖核多角体病毒－秋黏虫细胞表示系统，家蚕核多角体病毒－家蚕幼虫表示系统。Micro－GeneSys企业表示艾滋病基因工程疫苗，随即猪生长素、CD4膜蛋白及疟疾疫苗、鸡新城病毒疫苗、血吸虫GST疫苗、乙肝表面抗原、重组人GM－CSF等。日本同意用家蚕系统生产干扰素已上市。生物试剂盒标准品大多用昆虫表示系统生产。最少有600各种昆虫能够作为宿主，每年有数百个基因利用昆虫系统进行表示，越来越成为非常有用表示宿主。动物细胞制药的培养需求第19页优点1）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可。2）易喂养：家蚕丧失了野外生存能力，喂养，发育快，3）高量表示：用强开启子，外源基因可超量表示。表示产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。4）高效表示：可容纳较大外源基因（12kb），表示数个外源基因，而且正确装配成有功效分子。如表示抗体重链和轻链，自主装配成有功效抗体。5）翻译后加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后加工，包含糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸乙酰化、氨酰化等，大部分产物显示出良好活性。动物细胞制药的培养需求第20页缺点：1）重组率低，筛选困难，周期长，需要4－10天。2）外源基因表示在转染晚期，大约在20h后起始基因表示，在72－94h细胞裂解死亡，基因表示时间约30－50h，高水平表示不连续且时间短，这对表示不利。3）昆虫细胞糖基化等加工路径与哺乳动物细胞不完全相同，它不提供复杂N糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等改变。表示水平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。研究开发主要方向：有效病毒表示载体；决定基因表示时期开启子，无血清培养昆虫细胞系。动物细胞制药的培养需求第21页第二节基因工程动物细胞系构建

构建高效表示载体转染动物细胞筛选判定取得生产用工程化细胞系

动物细胞制药的培养需求第22页动物细胞表示载体：病毒载体，质粒载体。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表示时间较长。痘病毒载体可插入25～40kb外源基因，甚至是多个基因。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。美国Genentech企业已用SV40载体生产乙肝疫苗，其它载体可用于基因治疗。

动物细胞制药的培养需求第23页质粒载体：微生物质粒载体类似，普通是穿梭质粒，含有两个复制子和抗性筛选标识基因。大肠杆菌复制子，细菌中繁殖。抗生素抗性标识，原核细胞筛选。动物细胞复制子，在宿主细胞中稳定表示。还有丝状噬菌体复制子。

动物细胞制药的培养需求第24页开启子序列：含有RNA聚合酶识别和结合位点，方便有效转录。TATA盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频率。起源于病毒、动物基因和噬菌体开启子。动物病毒开启子：逆转录病毒长末端重复序列（LTRS）、SV40病毒早期和晚期开启子、腺病毒晚期开启子、人巨噬病毒（CMV）马上早期基因开启子。动物基因开启子：转录因子EF-1α开启子、泛素蛋白开启子、β-肌动蛋白开启子、干扰素-α开启子、IgG开启子、鼠金属硫蛋白基因开启子等。噬菌体T7开启子比动物基因开启子表示水平高。动物细胞制药的培养需求第25页PolyA信号序列：保持mRNA稳定性，预防降解，确保了转录产物加工和正确性，但序列不宜太长，防止能量过分消耗。添加PolyA信号和5′端转录暂停位点，能够降低上游序列转录通读造成背景。牛生长素（BGH）基因PolyA信号比SV40PolyA更强，惯用于高效表示载体中。终止序列：AAUAAA或连续终止密码UGA、UAA和UAG，能预防转录通读，使转录在正确位点结束。在转录起始点上游或下游使用相同类型增强子，有利于提升外源基因转录水平。动物细胞制药的培养需求第26页双顺反子表示载体：两个基因在同一开启子控制之下，内部核糖体进入位点使同一mRNA中第二个基因得到翻译。将dhfr与目标基因串连，dhfrcDNA插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因转录产物得到翻译。顺反子在多亚基蛋白偶联表示及其控制策略等方面有广泛应用前景。使筛选轻易，而且能高效表示。动物细胞制药的培养需求第27页选择适宜开启子，可实现定向表示。CMV开启子和人EF-1α开启子，可实现同一载体上二个基因独立表示。组织特异性开启子：如鼠、山羊酪蛋白开启子，可使基因主要在乳腺中表示。N端设计分泌信号肽：如Igκ链可变区和恒定区之间序列，使外源基因表示产物向胞外分泌。C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核、线粒体、内质网或细胞质中，这对基因功效研究非常适当。动物细胞制药的培养需求第28页基因扩增系统：在逐步提升选择压情况下，使选择标识基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提升表示基因水平。最惯用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（DHFR）基因系统和谷氨酰氨合成酶（GS）基因系统。氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使dhfr基因与目标基因大量增加，到达数千拷贝。硫胺蛋氨酸使GS系统基因得到大量扩增。动物细胞制药的培养需求第29页二、受体细胞1．人源细胞株系Namalwa：类淋巴母细胞，非整体核型。表示IgM，悬浮生长。外源基因表示水平较高，可用无血清培养基高密度培养，已成功地表示了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英国Wellcome企业用Namalwa细胞反应器达8000L，用Sendai病毒诱导，大规模生产α干扰素，并同意上市。WI-38：二倍体成纤维细胞系，2n=46，第一个被用于制备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。MRC-5：二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，对逆境有一定抗性也用于制备疫苗。动物细胞制药的培养需求第30页2．哺乳动物细胞株系CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离上皮样细胞系，贴壁型生长，是当前使用最为普遍和成熟表示糖基化蛋白药品宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表示外源蛋白，而内源蛋白分泌极少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高忍受能力。蛋白质翻译后修饰准确，表示产物结构、性质和生物活性靠近天然。有各种衍生突变株应用于药品生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺点株表示药品有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因拷贝数，提升蛋白质表示水平。动物细胞制药的培养需求第31页BHK－21：幼仓鼠肾脏中分离成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表示重组凝血因子Ⅷ已被获准上市。C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离取得上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表示各种外源基因，其中EPO水平达10mg/L，生产rhGH已被同意上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养物中分离建立连续细胞系，能大量表示外源蛋白，广泛用于药品毒理学研究。骨髓瘤细胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤细胞，分泌IgA，用于转染研究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。动物细胞制药的培养需求第32页杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合细胞中分离取得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，轻易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表示。很多杂交瘤细胞系用于抗体制备。Vero：从成年非洲绿猴肾中分离取得贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已经有突变细胞系能用无血清培养。最为惯用VeroE6增殖各种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被同意用于人体。也可作为转染宿主细胞，用于表示外源基因蛋白质药品和病毒检测。COS：是从SV40DNA转化非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到，广泛用于外源基因瞬时表示研究。GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗研究。动物细胞制药的培养需求第33页3．昆虫细胞株系Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，轻易放大，高效表示外源基因。Sf9：从秋粘虫卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最惯用昆虫表示细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表示外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表示重组蛋白能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。动物细胞制药的培养需求第34页三、细胞转染转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞技术通用名称。基因导入真核细胞方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导转化。方法表示类型毒性细胞类型特点基因枪瞬时，稳定无各种细胞组织，器官有效，仪器操作显微注射瞬时，稳定无各种细胞有效，技术难度大电穿孔瞬时，稳定无各种细胞有效，仪器操作冲击波瞬时，稳定无各种细胞，局部组织简单有效，仪器操作动物细胞制药的培养需求第35页方法表示类型毒性细胞类型特点逆转录病毒瞬时，稳定无对应宿主细胞有效原生质体融合瞬时，稳定无悬浮细胞技术复杂生物转染特点动物细胞制药的培养需求第36页化学转染是最惯用转染方法。其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）－葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，经过细胞内吞作用进入细胞。磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷DEAE－葡聚糖与带负电荷DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进DNA进入细胞。转染试剂盒商业化供给，尤其是脂质体材料转染试剂。影响原因：细胞培养物密度、DNA大小、纯度与用量、化学试剂用量与处理时间、促进剂使用等。动物细胞制药的培养需求第37页方法表示类型毒性细胞类型特点磷酸钙瞬时、稳定无贴壁细胞，悬浮细胞简单DEAE-葡聚糖瞬时有CV1，COS简单阳离子树脂瞬时、稳定有或无贴壁、原代悬浮细胞简单，有效化学转染特点动物细胞制药的培养需求第38页四、转染体筛选与分离转染后1～6天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因瞬时表示。为了取得稳定整合细胞系，先在非选择性培养基上培养24～48小时，让细胞倍增1～2代，使转染DNA表示。再按1：15百分比转移到选择性培养基上，每2～4天更换培养基，连续2～3周，促进抗性细胞生长，去除死细胞残骸，最终得到独立克隆。在转染中大约有万分之一细胞将稳定整合外源基因，所以需要显性选择标识来分离转染细胞。哺乳动物细胞选择标识，使用与之相对应选择剂。

动物细胞制药的培养需求第39页选择剂基因使用浓度氨甲喋呤dhfr－0.01～300μmol/L氨喋呤tk＋0.4μmol/L5-溴脱氧尿苷tk－30μg/mlG418,Zeocinneo100～800μg/ml潮霉素Bhyg10～400μg/ml杀瘟稻菌素bsd2～10μg/ml霉酚酸gpt25μg/ml嘌呤霉素乙酰基转移酶0.5～10μg/mlXyl-Aada4μmol/L动物细胞制药的培养需求第40页汇报基因特点使用与分析方法cat内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析lacZ有内源活性，X-gal染色，线性范围宽体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析碱性磷酸酶分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制体外，比色、化学发光或荧光分析gus蛋白质稳定，线性范围宽，X-Gluc染色体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析gfp无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线激发体内外，荧光分析动物细胞制药的培养需求第41页第三节动物细胞培养需求与培养基制备动物细胞离体后，失去了消化等系统，不能利用多糖、蛋白质等聚合程度高化合物。只能利用简单单体化合物如单糖、氨基酸等，为了维持细胞正常生长，还必须添加维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成份等。动物细胞对培养环境要求高，不一样细胞系要求也不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件靠近。动物细胞制药的培养需求第42页一、动物细胞培养营养需求1.糖类糖类是细胞主要营养物质，分解后释放出能量ATP。培养基中都必须添加葡萄糖，有时添加核糖等。提升细胞生长碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。动物细胞制药的培养需求第43页2.氨基酸氨基酸是蛋白质和酶组成单位。氨基酸还参加合成一些含氮化合物，核苷酸四种嘌呤和嘧啶碱基、儿茶酚胺等含氮激素及神经递质等。氨基酸可经过生糖或生酮路径转变为糖或脂肪酸，间接提供能量。动物细胞：8－10种必须氨基酸。离体轻易失去，20种氨基酸中最少12种是必需氨基酸：精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等。谷氨酰胺还可作为主要碳源和能源而被利用。动物细胞制药的培养需求第44页3.维生素维生素是一类微量小分子有机生物活性物质，对代谢和生长起调整和控制作用。水溶性维生素包含B族维生素和维生素C。B族维生素以辅酶或辅基形式参加酶反应，主要调整酶活性和代谢活性。维生素C，抗坏血酸，在体内参加还原反应、羟化反应，促进胶原蛋白合成和粘多糖合成，抗氧化作用。脂溶性维生素包含维生素A、D、E、K四种。维生素A维持正常视觉和上皮组织。维生素D为视固醇类化合物，主要是调整钙磷代谢。维生素E即生育酚，是抗氧化剂，预防生物膜中磷脂不饱和脂肪酸被氧化。维生素K，促进合成凝血酶原，促进血液凝固。动物细胞制药的培养需求第45页5.无机盐类无机盐是细胞代谢所需酶辅基，同时保持细胞渗透压和缓冲pH改变。Na＋和Cl－参加生理电活动，维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。离体培养为细胞提供足够Na和Cl离子是基本条件，普通生理盐水离子浓度（0.9%NaCl）。Ca2＋、Mg2＋，对细胞间互黏稳定起主要作用。在离体培养时，螯合细胞间Ca2＋和Mg2＋，能够到达分散细胞目标。磷是核酸、磷脂等组成成份。碳酸盐缓冲液是主要体内缓冲体系，与K＋、Cl－等在维持酸碱平衡含有主要作用。动物细胞制药的培养需求第46页6.生长类因子及激素细胞之间是相互联络，而非孤立。尤其是高度分化功效动物细胞更是如此。细胞离体生长时，必要添加激素与细胞生长因子等。胰岛素是最惯用激素，促进糖原和脂肪酸合成，对细胞生长有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲状腺素、乳激素、生育酚等。细胞因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子，依据不一样细胞添加。为了细胞贴壁生长，必需添加贴附因子，纤维结合蛋白、胶原等，伸展因子如表皮生长因子、成纤维细胞因子等。动物细胞制药的培养需求第47页二、动物细胞培养环境需求1.水与渗透压细胞生长离不开水，水是细胞反应主要介质。1）水是一个良好溶媒，营养物质在水中被吸收，废物在水中被排泄。2）含有热稳定性和导热性，调整稳定温度。正常血浆渗透压主要是无机盐Na＋、K＋、Cl－、HCO3－等组成，蛋白质组成胶体渗透压较小。动物细胞对渗透压有较强耐受性，惯用增减NaCl浓度调整渗透压，每增加1mg/mlNaCl，渗透压增加32mOsm/kg。离体培养细胞渗透压应控制为等渗透溶液。动物细胞制药的培养需求第48页2.温度不一样种类动物细胞对温度要求是不一样，变温动物对温度要求没有恒温动物严格。哺乳动物细胞最正确培养温度为37℃，鸡细胞为39－40℃，而昆虫类细胞为25－28℃。在培养过程中，依据细胞种类选择确定适宜培养温度。哺乳动物细胞耐受温度范围较窄，在35-37℃内能正常进行代谢和生长，超出范围会引发细胞伤害甚至死亡。细胞对低温耐受性比高温要强，低温抑制生长，但无伤害作用，在冰点温度附近仍能存活。动物细胞制药的培养需求第49页3.氧气动物细胞生长必须有氧气，无氧下，能取得能量供给，但细胞缺氧时不能生存。离体培养气体含有5％CO2和95％空气，其中氧浓度为21％。有时充以N2气稀释O2浓度。O2浓度在60%以上为高氧环境，对细胞毒性较大。4.pH值动物细胞对pH值很敏感，低于6.8或超出7.6会产生严重影响。机体细胞pH范围为6－8，血液和体液中，改变范围很小。人血液pH维持7.36-7.44。pH低于7.05会发生酸中毒，高于7.45发生碱中毒。细胞代谢产生CO2，使培养液变酸，pH发生波动。合成培养基偏酸性，为了稳定pH，可用缓冲体系配制。在开放体系中，CO2逸出，使培养基变碱。通入5％CO2，可维持在pH7.2-7.4范围内。动物细胞制药的培养需求第50页5.生长基质改变生长表面特征，促进细胞贴附物质。贴附细胞生长需要一个支持介质，采取在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞贴附和生长。生长基质为胞外基质成份，多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。生长基质已经有商业化产品，用PBS或BBS配成10倍贮存液，在37℃下包被，静置2－4小时或室温过夜，对器皿表面进行包被，然后无菌生理盐水洗涤后使用。有些还能够直接加入培养液。动物细胞制药的培养需求第51页生长基质贮存液浓度使用浓度使用方法多聚赖氨酸0.5mg/L0.05mg/L表面包被纤维连接蛋白10mg/ml1mg/ml加入培养液层粘蛋白

5～10μg/ml表面包被韧粘素75μg/ml5～15μg/ml包被或加入培养液胶原蛋白1～3mg/ml0.1mg/ml表面包被动物细胞制药的培养需求第52页6．抗生素动物细胞培养过程中，因为培养基营养丰富，很轻易被微生物污染。即使对使用抗生素仍存在质疑，但还是常添加抗生素，以防止轻度污染。抗生素使用浓度差异很大，普通范围为50～100μg/ml。在大规模生产中，除了青霉素和β-内酰胺类抗生素外，其它抗生素能够使用。抗生素使用对细胞会产生毒性，而且使试验室保留抗药性微生物，应加以注意和克服。动物细胞制药的培养需求第53页抗生素作用对象工作浓度（μg/ml）稳定性（天）两性霉素B真菌1～2.53制霉菌素真菌503氨苄青霉素G＋、G－细菌1003红霉素G＋细菌，支原体1003四环素G＋、G－细菌，支原体104庆大霉素G＋、G－细菌，支原体505利福平G＋、G－细菌503卡那霉素G＋、G－细菌1005链霉素G＋、G－细菌1003氯霉素G－细菌55青霉素GG＋细菌1003动物细胞制药的培养需求第54页三、动物细胞培养基种类与组成动物细胞对培养基要求高，不一样细胞系要求也不尽相同，所以培养基成份复杂而且昂贵。不过要尽可能提供与体内生活条件靠近培养环境。主要组成成份以下：糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成份等。不一样细胞对葡萄糖利用相同，但对氨基酸利用相差很大，不一样细胞过程对氨基酸需求存在差异。当前停留在流加谷氨酰胺上。动物细胞制药的培养需求第55页血清：蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素和生长因子等。胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用为胎牛血清和新生牛血清。水解乳蛋白和胶原富含氨基酸。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。脂类化合物对动物细胞培养是必需，实际中类脂及其前体和血清常平行使用。添加蛋白质试剂主要有铁传递蛋白，起离子载体作用，有时用无机铁盐代替。胰岛素起生长素作用，白蛋白起保护剂作用。其它附加成份如核苷类及丙酮酸盐等是培养基必需成份，有利于细胞克隆和特异化细胞培养。动物细胞培养过程中，被微生物污染。常添加抗生素，以防止轻度污染。动物细胞制药的培养需求第56页1.天然培养基直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，成份复杂，不稳定，起源受到限制，不宜大量培养和生产使用。2.合成培养基合成培养基用化学成份明确试剂配制培养基，组分稳定。现在已经有几十种合成培养基，大部分已商品化。组成：无机盐、糖、氨基酸、维生素及其它成份。因为细胞种类和培养条件不一样，所用合成培养基也不一样，在动物细胞培养中最惯用培养基有7－8种。动物细胞制药的培养需求第57页3.无血清培养基无血清培养基是全部用已知成份组配、不加血清合成培养基。在含有营养和贴壁因子基础培养基中，加入适宜细胞生长因子，细胞良好生长，适合于制药生产。无血清培养基提升了培养质量，防止了使用血清带来麻烦，产品纯化轻易，组分稳定，可大量配制。无血清培养基通常需要添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子营养成份等。大多数无血清培养基含有蛋白质和激素等大分子物质，适宜于各种细胞系培养。对于大规模生产用无血清培养基，往往成份不完全清楚，但简单而且低成本。动物细胞制药的培养需求第58页四、培养基控制1.培养用水质细胞培养水质最低要求电导率在1X106Ωcm以上。水存放时间不宜超出2周。对于制药，必需使用纯净水配制培养基，普通水必需除去各类元素有毒或有害物质及微生物，还必需除热源，到达纯净水标准。2.缓冲液缓冲液：弱酸与弱酸盐或弱碱与弱碱盐组成，pH恒定但不干扰试验。不一样种类细胞对pH要求不一致，不一样生长阶段对pH要求也不一样。原代细胞pH要求严格，而传代细胞要求较宽。细胞培养过程中代谢产生酸性物质，使培养基pH不停下降。缓冲液中和培养液中酸性物质。动物细胞制药的培养需求第59页最广泛使用为碳酸氢钠/碳酸,其次为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，调整二者百分比，配制成不一样pH缓冲液。碳酸盐缓冲液除了直接缓冲作用外，还有间接作用，碳酸生成挥发性CO2后很快逸出。细胞呼吸产生CO2与水形成碳酸，任何碱在培养液中都被中和，生产对应碳酸氢盐其它缓冲液:Tricine-Glycine、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、HEPPSO等等有机缓冲液，缓冲能力强。Tris所含氨基含有高化学反应活性，能抑制细胞生长，并经过生物膜，它调整pH要依赖于温度改变，所以不宜作为培养液。离体培养中，缓冲液多为平衡盐溶液主要组分之一，极少单纯使用。动物细胞制药的培养需求第60页3.生理盐水与平衡盐溶液在缓冲液基础上，添加调整渗透压盐类，在一定程度上能满足细胞对pH和盐离子要求。缓冲液或缓冲盐溶液用于:配制溶液,处理细胞溶液。对于直接接触、长久培养培养液，惯用生理盐水和平衡盐溶液，是渗透压与胞浆渗透压平衡溶液。生理盐水供给细胞水分和各种离子，维持一定渗透压，并能良好溶解试剂和药品。有各种不一样成份生理盐水，分别加入pH缓冲剂与指示剂、葡萄糖，形成平衡盐溶液。平衡盐溶液：集缓冲液缓冲能力、生理盐水等渗能力、营养供给为一体，含有各种功效和作用。动物细胞制药的培养需求第61页BSS配制：1）先分别溶解CaCl2、MgCl2、MgSO4。2）在另一容器中依次溶解其它试剂。3）在另一容器中用5.6%NaHCO3数滴溶解酚红。4）将含Ca2+、Mg2+溶液迟缓倒入步骤2配制溶液中，搅拌，预防沉淀。5）再加入酚红溶液。6）补足水，并用NaHCO3调整pH。含葡萄糖BSS过滤除菌，不含葡萄糖时常规高压灭菌。小量培养液可置4度保留。一旦出现沉淀，要重新配制。动物细胞制药的培养需求第62页注意事项：细胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，对于DL混合型氨基酸，使用量应该加倍。谷氨酰胺溶液中很不稳定，要单独配制成浓缩液。NaHCO3普通配成3.7％、5.6%、7.4%三种浓度，过滤除菌或高压灭菌，4度保留，使用前加入，调整培养基pH。为了优化细胞生长环境，还添加其它成份，如嘌呤和嘧啶类，维生素C、谷胱甘肽、巯基乙醇。普通情况下，培养基成份如氨基酸、维生素、葡萄糖、缓冲液等、补充因子几类，先配制成高倍浓缩母液，过滤灭菌，冷藏。使用时按一定百分比稀释，配制成工作液。动物细胞制药的培养需求第63页第二节动物细胞增殖生长动力学过程一、单细胞生长增殖周期从一个细胞分裂形成两个新细胞过程为一个细胞周期或一个细胞世代。单个细胞周期包含细胞间期、细胞分裂期，间期又包含间期1、DNA合成期和间期2三个时期。不一样细胞类型其分裂周期及各期时间都不一样，培养条件及培养基成份也会影响细胞周期,普通地动物细胞分裂周期为12－48小时,经典细胞周期为24小时。对连续细胞系，失去了细胞周期控制，人工培养条件不适，细胞将发生程序化死亡即凋亡。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等可引发凋亡发生。

动物细胞制药的培养需求第64页二、细胞群体生长过程细胞群体生长增殖过程与微生物生长增殖过程相同1.潜伏期，细胞经历一段悬浮状态，贴附于器皿表面。2.对数生长久：细胞分裂旺盛，指数增加。细胞相互接触汇合成片，接触抑制，限制分裂和运动，密度不再增加。3.静止期：分裂数与死亡数相等相对动态平衡时期。4.衰亡期：细胞死亡数目大于分裂数目标时期。三、群体细胞生长动力学参数细胞分裂代数G就可用以下公式计算：G＝logN－logN0）/log2动物细胞制药的培养需求第65页第四节动物细胞分离与培养一、细胞种类生物体是由各种多样分化细胞组成，如人体细胞类型达200余种。这些细胞都是由受精卵分裂产生细胞后代生长增殖分化而来。不一样细胞含有不一样功效，细胞分化异常造成癌变。分化程度越高，脱分化能力越差。在胚胎发育过程中，高等动物细胞分化是由全能性变成多能性，再变成单能性，进而失去再分化能力。即使成熟细胞不能再分化，但其细胞核依然含有全能性，所以能够经过核移植，克隆动物。动物细胞制药的培养需求第66页体外培养细胞，可分为原代细胞系、传代细胞。原代培养：从体内取出组织细胞进行体外接种培养，原代培养细胞为原代细胞，它生长分裂并不旺盛，与体内细胞相同，适合于药品检测试验。生产中有些产品仍沿用原代细胞，如鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。传代细胞:原代细胞转接后培养细胞。传代后，细胞分裂增殖旺盛，能保持一致二倍体核型，所以又成为二倍体细胞系。传代细胞增殖能力有限，所以也称为有限细胞系。如WI－38、MRC－5、2BS等用于生产。动物细胞制药的培养需求第67页依据细胞传代次数和寿命，可分为有限细胞系和无限细胞系或连续细胞系。有限细胞系:正常细胞经过屡次传代后，普通可连续培养30－50代，就会逐步失去增殖能力，也就是说它们只能生长有限时间，经过若干传代培养后将老化死亡。无限细胞系：当细胞经过自然或人为原因转化为异倍体后，才能变为无限细胞系。如肿瘤细胞就是自发形成永久细胞系，没有分裂次数限制。物理、化学或生物原因也能取得。细胞寿命无限，生长不受细胞密度影响，倍增时间短不具接触抑制现象，它对培养条件和生长因子等要求低，，非常适合于工业化生产，理想药品生产细胞系。动物细胞制药的培养需求第68页依据细胞对生长特征和对基质依赖性，可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞：生长需要在适量带电荷固体或半固体支持表面，细胞本身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖，大多数动物细胞都属于这类。非贴壁依赖性细胞：生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，有时被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和一些转化细胞属于这类，生长干扰素Namalwa细胞。有些细胞对支持物依赖性不严格，可贴壁生长，可悬浮生长。中国仓鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞、BHK细胞。动物细胞制药的培养需求第69页二、工程细胞取得与保留当前用于制药动物细胞有4类，即原代细胞系、二倍体细胞系、异倍体细胞系和融合或重组工程细胞系。细胞无限传代，使大规模工业化生产药品成为可能。异倍体细胞用于产生重组基因工程产品，使动物细胞成为药品生产一个新领域。动物细胞制药的培养需求第70页1.原代细胞系分离与培养用原代细胞系生产药品需要大量动物。动物组织或器官洗涤粉碎酶解消化离心或过滤接种培养培养液稀释细胞洗涤37度消化，检验是否充分和完全。胰蛋白酶：细胞间质较少软组织，胚胎、肝、肾及传代细胞胶原酶：纤维、上皮、癌组织工作浓度：0.1-0.3mg/ml链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶动物细胞制药的培养需求第71页2.传代细胞培养长满器皿表面细胞进行分离，接种到新培养基上，进行新一轮培养。掌握好最正确时期：刚才全部汇合细胞，过早产量低，过晚健康状态不佳。过程与原代细胞相同，用30－50倍体0.25％胰蛋白酶和EDTA对细胞块消化，消化后再培养。要注意消化程度，细胞对酶反应不一样，有敏感，掌握好适宜消化时间和方法，不要过分，取得细胞浓度均匀，生长速度一致传代细胞。曾经广泛应用，但不是理想生产细胞系动物细胞制药的培养需求第72页3.细胞系建立与保留一旦取得了稳定有一定特征细胞系，就建立细胞库，进行长久保留。依据药品生产相关要求，必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库。WCB1QCWCB2QCQC原始培养物MCBQC内容：细胞活性检测、无菌试验、核型、DNA分析、同工酶分析、支原体试验、其它外源物试验、稳定性和基因型分析等，工作细胞库必须与主细胞库完全一致。

动物细胞制药的培养需求第73页低温冷冻保留：用冷冻保护液（含10％血清培养液，附加10％甘油或7.5%-10%二甲基亚砜）细胞预冷，稀释成106细胞/ml。分装，火焰下封口。迟缓冷冻，细胞放入CO2低温冰柜或液氮中，温度为-150—-190℃，细胞全部活动几乎处于停顿状态。复苏细胞：冷冻细胞取出，马上在37℃水浴中，快速融化。在保护剂存在下，慢冻快融是保留复苏细胞要领。融化后细胞可用于深入试验。动物细胞制药的培养需求第74页三、大规模培养方法依据动物细胞生长特点，只能采取悬浮培养、贴壁培养、固定化培养等三种主要方法进行大规模培养。1.单层贴壁培养细胞贴附于一定固体支持表面上，进行培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴壁培养是动物细胞培养一个主要方法。接种后，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面，然后进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。普通数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。贴壁培养容器:转瓶、玻璃珠、微载体和中空纤维等。滚瓶是为早期培养所采取，结构简单，投资少，重复性好，但劳动强度大，占用空间大，产量低，不易控制和监测。动物细胞制药的培养需求第75页细胞贴壁原理：细胞主要靠静电引力和范德华力贴附在固体表面，因为动物细胞在生理状态下带负电，贴壁培养固体表面要求含有正电荷和高表面活性。适宜电荷密度是粘附和贴壁关键，电荷密度低，不能有效粘附，电荷密度高则会对细胞产生毒性。优点：轻易更换培养液，灌注培养时，能到达高细胞密度；有利于产物分泌表示，可改变培养液与细胞百分比。缺点：操作较烦杂，检测受到一定限制，培养条件难以均一，传质和传氧差，放大培养是瓶颈。

动物细胞制药的培养需求第76页2．微载体培养微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中。微载体培养兼具贴壁和悬浮培养双重优点，有很大比表面积，供单层细胞贴附和增殖。悬浮微球使细胞生长环境均一，培养基利用率高，重复性好，降低了劳动强度，轻易放大，于20世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原等。多孔微载体或多孔微球，极大地增加了比表面积，如Cytodex-1比表面积达6000cm2/g，Cytopore比表面积达28000cm2/g。商品化微载体基质有玻璃、葡聚糖、纤维素、塑料和明胶等，表面带电基团为DEAE等。动物细胞制药的培养需求第77页玻璃珠：直径约2～3μm，密度1.5g/cm3，难以在低速下悬浮。在玻璃表面覆盖塑料，可得到低密度微载体，如Bioglas和Ventreglas，而中空玻璃也可到达此密度。葡聚糖微载体：带正电，干粉可在pH7.2磷酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。Cytodex2：电荷性大大下降，吸附能力很低，适合于蛋白质药品生产。纤维素微载体DE52和DE53：适合各种细胞培养。塑料载体Biosilon是聚乙烯载体，无吸附性能，可重复使用，但贴壁较慢，对细胞摩擦损伤较大。聚丙烯酰胺载体贴壁较快，亲水性。动物细胞制药的培养需求第78页微载体选择依赖于搅拌系统和工艺过程，可用于转瓶、搅拌烧瓶和气升式反应器等。为了提升贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。在悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。

动物细胞制药的培养需求第79页多孔微载体：直径0.2～5mm，孔径20～300μm，达占总体积85%，可实现细胞固定化，到达高密度培养。广泛使用多孔微载体有Cellsnow、Cytocell（纤维素基质）、Verax、Cultisphere（胶原）、Cytoline1和2（聚苯乙烯）、ImmobaSil（硅橡胶）及Siran（玻璃）等。主要用于搅拌反应器、固定床和流化床反应器。

动物细胞制药的培养需求第80页贴壁培养固体表面要求：正电荷和高度表面活性。玻璃、聚苯乙烯塑料、不锈钢金属材料和微载体、多孔微载体或多孔微球。商品化微球基质是葡聚糖、聚丙烯酰胺、明胶交联、聚苯乙烯和纤维素等，带电基团为DEAE等。微载体有CytodexI、II、III和DEAE－纤维素等，已是主要培养方法。理想微载体所具备性能：质地柔软，微球间摩擦轻；耐高温，可高压灭菌；透明性，便于观察细胞生长；细胞相容性，利于贴附和生长；无毒性和惰性，对细胞无毒害，不产生有害物质，不吸附培养基；低速即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获；微粒大小均匀；可回收重复使用。动物细胞制药的培养需求第81页3.悬浮培养细胞在反应器内游离悬浮生长培养过程,主要对于非贴壁性依赖性细胞，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵基础上发展而来，经常借鉴发酵理论和经验，但有本身特点，因为动物细胞没有细胞壁，不能耐受猛烈搅拌和通气剪切，对环境适应性差。在悬浮培养中要注意发挥动物细胞特征。惯用反应器有通气式搅拌混和气升式生物反应器。方法优点是操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧很好，轻易放大培养。细胞体积小，密度低，培养病毒易失去标识而降低免疫能力。动物细胞制药的培养需求第82页4.固定化培养细胞包埋在微载体内或胶囊内，即细胞固定化后，进行悬浮培养。适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞培养。细胞密度高、抗剪切力和污染等优点，是生产首选方法。吸附：经过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面，微载体和中空纤维培养等。共价交联：双功效试剂处理细胞，使细胞之间交联固定化方法。包埋：细胞包埋在载体内部。网格型为高分子凝胶细网格，而微囊型为高分子半透膜。包埋材料有些人工聚合物、琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等。动物细胞制药的培养需求第83页微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。多聚赖氨酸/海藻酸固定细胞：凝胶载体表面被多聚赖氨酸覆盖，形成一层多孔可透薄膜，再使凝胶载体液化，便可制成微囊。杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合，经微囊发生器，微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，再用柠檬酸去钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞在在微囊内悬浮。微囊化固定培养工艺在单克隆抗体生产中取得成功，使抗体截留在膜内，血清中蛋白质被排出在膜外，产物浓度和纯度较高。培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体，纯化工艺简单，应用前景广。动物细胞制药的培养需求第84页三、细胞培养操作方式动物细胞培养操作方式与微生物培养基本相同。（一）分批式操作已用于搅拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞周期为3～5天，细胞密度达2～5×105/ml，最大比生长速率大约为0.05h-1。单克隆抗体产量约10～100mg/L。在大规模搅拌反应器中，细胞密度较低，最终达5×106，而在750～1500cm2转瓶生产中，细胞密度达1～2×108。动物细胞制药的培养需求第85页(二)流加式操作最常见流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。经过流加控制，可实现高密度培养。杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4×107，生产抗体产量比分批操作提升几～10倍，可达500mg/L。因为培养体积不停改变，流加对过程控制能力依然有限在实际生产中应用少。动物细胞制药的培养需求第86页（三）半连续式操作动物细胞培养生产药品中经常采取。已应用于大规模生产乙肝表面抗原、tPA等基因工程产物。半连续操作尤其适合用于分泌表示型细胞，如杂交瘤细胞培养，尤其是微载体系统。微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后，重复收获细胞分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。该方式操作简单，使细胞密度和产量维持在较高水平，能在较长时间内进行连续生产，重复收获产物，生产效率高，是动物细胞培养生产药品中经常被采取方式。动物细胞制药的培养需求第87页（四）连续式操作不停收获产物，生产中用于非贴壁依赖性细胞培养。在动物细胞培养中，比生长速率比稀释速率大。极难建立单一限制性基质衡化培养，需要各种营养物质流加。稀释速率可从0到最大生长速率之间改变，高稀释速率将带出细胞。在稳态，抗体生产可维持几个星期甚至几个月。连续操作培养条件稳定，抗体处于最正确生产状态，可准确控制最优化参数，产率较高，但必须控制培养基流加速度和液位高度。动物细胞制药的培养需求第88页（五）灌流式操作细胞被截留在反应器内连续操作，是最受推崇用动物细胞生产药品方式。截留细胞方式：过滤系统有两种，一个是安装在反应器内部或外环旋转过滤器，另一个是切线过滤设备。灌流体系：100％截留细胞，如固定化包埋细胞，可经过中空纤维、平板膜、凝胶颗粒和微囊等实现；部分截留细胞，如使用微载体系统、贴壁系统、分离悬浮系统等实现，其中分离悬浮系统包含使用膜过滤、旋转过滤、离心、重力沉降等分离技术。流化床包埋培养人鼠杂交瘤细胞，整个反应器有效浓度达4×108/ml，单位体积产量提升200～300倍。动物细胞制药的培养需求第89页优点：1）大大提升了细胞生长密度和产物浓度。2）利用培养基，降低细胞代谢废物，细胞生长良好。3）产物为分泌蛋白质，滞留时间短，防止了产物聚合、降解等产量和活性形式改变，有利于纯化。4）中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物反应器等唯一可操作方式。缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，因为过滤器轻易堵塞，从而限制培养次数。动物细胞制药的培养需求第90页四、动物细胞培养反应器（一）转瓶最早大规模培养反应器。结构简单，操作培养简便，不进行过程控制。现在主要用于生产疫苗如流行性腮腺炎、风诊麻疹等或用作种子罐。（二）搅拌罐反应器其结构与微生物发酵罐相同。主要区分：较低高径比，满足细胞对溶解氧需求；低搅拌转速，大幅倾斜度桨叶或无桨，防止机械伤害；圆形罐底，预防细胞及载体沿体壁沉积。大规模培养生产药品主要设备，用于悬浮细胞、微载体、微囊和巨载体培养等。动物细胞制药的培养需求第91页(三)气升式生物反应器没有搅拌装置，气体从罐底喷射管进入反应器导流管。湍流温和而且均匀，循环量大，细胞与培养液混合均匀。剪切力小，细胞伤害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良好。适合用于悬浮细胞分批培养，微载体和连续培养。已经有全自动密闭结构气升式反应器，气体从罐底输入，沿中央内管上升，一部分气体溢出，另一部分被引导沿罐内壁下降，抵达底部与新气体混合再度上升。经过计算机控制混合气体组分，维持培养基内容氧和pH值。Celltech企业气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。抗体合成大多数处于稳定时和衰退期，不一样细胞株系，生产周期为140－400h。从10L逐层放大到10000L，共17d，生产抗体100g，比传统摇瓶提升约5倍。动物细胞制药的培养需求第92页动物细胞制药的培养需求第93页(四)流化床生物反应器细胞固定在多孔微载体中，培养基以适当流速自下而上经过，使多孔载体处于悬浮流态反应器。Verax企业CF－IMMO多级和SF－流化床反应器，用于生产疫苗和基因工程产品。上部微载体依靠沉降作用与培养基分离，一部分培养基被搜集，提取产物，同时排出部分废物；其余部分再流加等体积新培养基，提供营养，实现高密度培养。这种反应器结构比较简单，传质性能好，采取膜气体交换器，能快速提供氧气。动物细胞制药的培养需求第94页固定床反应器：填料为无细胞毒性生物兼容性可附着细胞惰性材料，能够是不锈钢、玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料。与流化床反应器区分为固定床反应器使用实心载体，流化床反应器使用有孔载体。现用多级流化床和多孔微球培养。动物细胞制药的培养需求第95页（五）中空纤维生物反应器一个特制圆筒，内部装有数千根中空纤维管束。接种孔水套层产物出口培养基入口产物出口培养基入口内膜外膜腔室细胞培养基分散后,灌入床层。纤维管壁薄，半透膜，截留不一样分子量。纤维管空腔组成内室：灌流含氧气培养基纤维管之间空间组成外室：细胞生长。动物细胞制药的培养需求第96页细胞接种于外室，贴附在纤维外壁，吸收从内室渗透出来营养成份，生长繁殖。1－3周后可占据全部纤维空间，并在纤维外壁表面上堆积成多层，细胞密度可达108/ml。细胞分泌产物和血清中成份因为分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。细胞代谢废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，防止了对细胞毒性。在收获时，打开纤维管之间外室开口，产物就流出来。此时即使细胞停顿分裂，但细胞存活、健康和核形态不变，代谢和分化功效仍可保持数月。动物细胞制药的培养需求第97页纤维材料:聚砜、丙烯共聚物、聚丙烯、纤维素、醋酸纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯等。纤维素亲水性强，对渗透性影响较大，不适合于Vero细胞及其它贴壁细胞培养。醋酸纤维和聚甲基丙烯酸甲酯亲水性弱，极性大，适宜于贴壁细胞培养。优点:占地小，产量和质量高，成本低。不足:不能重复使用，不耐高压灭菌，只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌，不能取样检测。中空纤维反应器是模仿了生物体内毛细血管系统，应用广泛，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。已经有多家企业生产制造和销售中空纤维生物反应器，其发展趋势是到达高密度培养目标。动物细胞制药的培养需求第98页第五节

动物细胞增殖行为与培养过程动力学

一、动物细胞增殖周期单细胞增殖周期：细胞间期间期1(G1)、DNA合成期(S期)、间期2(G2)细胞分裂期（M期）。动物细胞制药的培养需求第99页M期为有丝分裂期，超螺旋化染色单体，经过前期、中期、后期和末期，被纺锤体拉向两极，中间形成细胞板，一个细胞分裂成两个子细胞。M期普通时间很短，为0.5～1小时。同一类细胞周期及其各期连续时间是一定，但不一样类型细胞分裂周期及各期时间都不一样，差异主要取决于G1期，而S和G2期相对稳定。对连续细胞系，失去了细胞周期控制，培养条件及培养基成份会影响细胞周期。当人工培养条件不适，细胞将发生程序化死亡即凋亡过程，整个细胞分解后被膜包裹形成凋亡小体。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等均可引发凋亡发生。动物细胞制药的培养需求第100页二、悬浮培养细胞生长动力学体外培养细胞是以群体形式进行增殖和生长，其动力学过程与单细胞微生物生长相同。动物细胞培养关键参数是活细胞浓度，可用细胞比生长速率（μ）、比死亡速率(Kd)和活细胞分数(fv)来描述，计算生长动力学。动物细胞制药的培养需求第101页1．悬浮培养细胞生长普通动力学充分混合悬浮培养游离细胞反应器，假设流加操作时流出率为0，分批操作时流加率和流出率均为0，密度不变，反应器内则质量守恒：V：反应器内培养液体积，Fi：流加新培养液体积速度，Fo：消耗培养液体积流速。动物细胞制药的培养需求第102页假定总细胞处于平衡状态：总细胞积累速率=细胞流加速率－细胞流出速率＋细胞生长速率－细胞裂解速率。在不进料情况下，总细胞平衡：

N：细胞总浓度，uap：表观比生长速率，包含细胞生长和死亡。

动物细胞制药的培养需求第103页只有活细胞才能分裂，并假定活细胞不发生死亡：μ为真实比生长速率;Nv为活细胞浓度;Nd为死

细胞浓度;kl为死细胞比裂解速率。

活细胞占主导，死细胞裂解可忽略，即kl＝0，那么动物细胞制药的培养需求第104页当活细胞转变为死细胞时，没有直接改变细胞总浓度，那么活细胞处于平衡：

μa为活细胞表观比生长率：

动物细胞制药的培养需求第105页对于连续培养，反应体积恒定，所以Fi=Fo=F。取样对反应器V影响可忽略。表观比生长速率：D为稀释速率（Fo/V）动物细胞制药的培养需求第106页细胞活性降低时，μ远离μap（D恒定）。细胞死亡速率：

在高稀释速率下，死亡速率较低。只有在低稀释速率时，死亡速率才主要。

动物细胞制药的培养需求第107页2．分批培养分批培养时，Fi=Fo=F=0。用D=0替换前面方程，可得到分批培养μap、μ、kd。在kl较小时（稳定时）成立，直到静止后期或死亡期。动物细胞制药的培养需求第108页3．流加培养流加体积对反应器效率影响很大时，Fo=0，但Fi≠0，所以V不是常数。不用细胞浓度，用细胞数目（分别为NV或NvV）解方程，得出到流加培养时总细胞、活细胞表观比生长速率、比死亡速率分别为：动物细胞制药的培养需求第109页5．截留细胞连续培养流出总细胞浓度为No=αsN，αs为流出液细胞浓度与反应器中细胞浓度比率，截留速率（反应器中截留细胞分数）为1-αs。对于Fi=Fo=F，V恒定体系，总细胞浓度为：D替换为αsD，可得到μap、μ、kd

动物细胞制药的培养需求第110页6．细胞裂解期低稀释速率连续培养（不论细胞是否截留）和分批培养静止后期和衰亡期，细胞活性较低，细胞裂解相当主要。高速搅拌时，细胞裂解也很严重。计量细胞生长参数，必须考虑细胞裂解。可用细胞释放到培养液中乳酸脱氢酶（LDH）表征。依据培养液中LDH浓度可预计死细胞数目（包含完整和自溶细胞）。

动物细胞制药的培养需求第111页三、微载体培养细胞生长动力学在灌流体系中，载体被截留，游离细胞随流出液而流出。体积恒定灌流体系中，总细胞平衡为：

表观比生长速率：细胞释放速率：：动物细胞制药的培养需求第112页四、细胞培养代谢动力学代谢系数：单位活细胞消耗速率和生产速率，它直接反应了培养过程中代谢参数随时间和培养条件改变。用它进行不一样细胞种类或培养条件之间比较，比单位时间内营养和产物改变要轻易和可靠。

动物细胞制药的培养需求第113页1.悬浮培养对于截留细胞、不截留产物蛋白质反应器，代谢产物平衡浓度M可表示为：MF为进料液中浓度。M为反应器中浓度代谢系数qM为M比生成速率（单位细胞、单位时间生成摩尔数）

动物细胞制药的培养需求第114页对于恒定体积反应器，代谢系数为：

乳酸/葡萄糖，O2/ATP,氧/葡萄糖、氧/谷氨酸、氨/谷氨酸、目标产物/氧等表观得率，把代谢、底物消耗和产物生成连系起来，预计有氧代谢与糖酵解关联程度。

动物细胞制药的培养需求第115页2.固定化细胞培养极难确定固定化细胞反应器中细胞浓度。但可从流入和流出液中测定氧和代谢产物浓度，用代谢产物对时间作图，经过代谢系数预计细胞密度。代谢产物M体积得率为：

动物细胞制药的培养需求第116页五、细胞培养产物生成动力学产物截留培养体系产物截留与细胞截留一样，有利于收获高浓度产物。在截留产物培养体系中，都不能100%截留。在恒定体积反应器中，经过滤膜截留产物时，产物质量平衡为：动物细胞制药的培养需求第117页第六节动物细胞培养过程检测与工艺控制

检测系统和控制系统是当代生物反应器所不可缺失，检测全方面性和准确性代表了反应器本身水平和性能。经过一系列参数检测，能够准确掌握反应器运行状态，如细胞是否处于最正确生长状态，有没有污染，产物积累情况等，采取对应办法，调控反应过程，实现高效生产。动物细胞培养中，检测参数包含细胞生长环境参数（温度、pH、溶氧、转速、液流量）；培养基成份改变参数（葡萄糖消耗率、乳酸生成率、铵离子浓度）；细胞生长状态参数（形态改变、活性高低、密度大小）；目标产物生产率（产物合成与积累速度，分泌）；微生物污染参数。全方面检测这些参数才能做到准确控制整个工艺过程。动物细胞制药的培养需求第118页一、细胞生长状态检测1.细胞计数与活性分析离线分析：用血球计数板计数，或进行分光光度计比色分析，确定反应器中细胞数目。在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活性控制结合在一起。其它方法有测定电导与电容传感器和软件传感器，甚至是实时成像分析检测。检验细胞活性：组织化学染色法和细胞形态观察检测细胞活性。动物细胞制药的培养需求第119页2.细胞凋亡检测细胞死亡有两种形式，即凋亡和坏死，其形态学和生化改变完全不一样。坏死：细胞受到严重伤害时快速膨胀，染色质凝聚，而死亡，细胞直接裂解，坏死过程不受细胞自主控制。凋亡：细胞对环境改变作出有计划、执行预定程序应答过程。其特征是细胞收缩，细胞核和DNA断裂，同时被膜包裹形成带凋亡小体。在体内，凋亡小体被邻近细胞或巨噬细胞所吞噬。动物细胞制药的培养需求第120页检测：光学显微镜检验；荧光显微镜下观察：荧光染料（Hoechst，Hoechst/PI,丫啶橙/溴化乙锭）对细胞染色细胞流式分析：检测培养过程中细胞凋亡。琼脂糖凝胶电泳：凋亡主要生化特征是激活一个Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶，将核DNA切割成200bp或更大片断。而坏死细胞不会出现DNA断裂片段。动物细胞制药的培养需求第121页在动物细胞培养中，细胞凋亡是很普遍现象，在各种环境下都能发生。培养基除去生长促进因子时，生长因子依赖性细胞系就发生凋亡。改变培养基条件，缺乏锌元素，细胞密度过高，都会引发细胞凋亡。细胞毒素也可能引发细胞凋亡。凋亡细胞能排斥活体染料，台盼篮染色排除法往往低估了细胞健康状态。动物细胞制药的培养需求第122页二、微生物污染检测与预防细菌污染:汤培养基于37℃恒温培养，检验。类胸膜肺炎生物体污染：细胞仍能生长，甚至无显著改变，经常不易发觉。支原体污染:染色、培养、DNA杂交和共培养，最少同时使用两种方法。Hoechst33258荧光染色，荧光显微镜观察。使用抗生素，卡那霉素、金霉素处理培养物。用特异性支原体血清处理，可永久去除污染。高温处理，支原体和细胞耐热性不一样，支原体敏感。使用支原体去除剂：日本制药株式会社MC-2120。动物细胞制药的培养需求第123页三、培养基成份检测与代谢控制1．基质消耗检测营养消耗能够用葡萄糖降低为指示，而产物积累能够用乳酸和铵增加作为指示，动态检测这两种物质改变，判别细胞状态是否正常。近红外测量技术可实现葡萄糖在线测定。固定化和中空纤维反应器，用NMR分析培养空间成份，判定和定量分析代谢产物。也可区分增殖和非增殖细胞。分批培养中，葡萄糖起始浓度普通为5～25mM，谷氨酰氨起始浓度为2～6mM。控制氨离子浓度低于2～4mM。乳酸低于约60mmol/L。动物细胞制药的培养需求第124页2.代谢控制过量葡萄糖，增加乳酸。过量谷氨酰胺会造成铵离子、丙氨酸或天门冬氨酸积累。葡萄糖限量：能降低乳酸量，增加葡萄糖产量系数。谷氨酰胺限量：降低铵盐和氨基酸生成。进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和铵离子将同时降低，使细胞代谢变得更有效。在生产工艺中，优化二者之间关系，使之协调起来。把细胞活力、ATP、DNA和蛋白质含量，与生物量或细胞计数、底物和产物代谢改变相结合，评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。

动物细胞制药的培养需求第125页当前代谢控制主要是采取各种复杂参数，包含生长速率、吸收速率、产率和细胞内代谢产物，是依据基础参数和生物化学参数计算而来。可用于培养过程快速控制。仅依据细胞密度值和流加速率计算生长速率，意义并非很大。因为两次测定时间间隔较长，数据本身就后滞，可靠性较差。对于生长速率恒定连续培养，细胞内ATP含量与生长速率相关，自动取样后，用相关试剂盒对ATP总量进行在线分析，由在线传感器和计算模型得到实际细胞数目。这么，经过营养控制或温度调整可维持连续培养恒定生长速率。动物细胞制药的培养需求第126页氨基酸比吸收速率和比生成速率、细胞内酶(如乳酸脱氢酶，谷氨酸草酰乙酸转氨酶)比释放速率，都可作为培养过程瞬间参数和控制节点阀值。假如能自动检测产物并计算产率，可经过计算机程序可使过程自动优化。多元参数分析计算程序，能改变全部相关参数，最终找到一个最正确生产条件。用HPLC在20分钟内得到准确结果，而HPCE只需5分钟。这些新方法要用于培养过程分析，还需深入发展和完善。

动物细胞制药的培养需求第127页四、搅拌剪切检测与控制1．搅拌剪切检测搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提升氧及其它营养物质传递速率，但搅拌产生剪切力会对细胞造成损伤。过分搅拌引发细胞损伤可用细胞外蛋白浓度来表征，它决定了细胞裂解