实验过氧化物酶活性的测专家讲座

2023/3/9一、试验目标

1.学习红薯过氧化物酶制备方法。

2.掌握过氧化物酶反应原理及测定方法。

实验过氧化物酶活性的测专家讲座第1页2023/3/9二、试验原理

1、过氧化物酶（简称POD)介绍过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高一个酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素氧化等都相关系。在植物生长发育过程中它活性不停发生改变。普通老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含一些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发觉早衰减产水稻根系中过氧化物酶活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化一个生理指标。另外，过氧化物同工酶在遗传育种中主要作用也正在受到重视。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第2页2023/3/92．酶活力测定(1)酶活力表示酶量多少不能像普通物质那样，用重量(g)或体积(ml)。因为酶是一个生物催化剂。酶存在和含量多少应表达在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身重量不能说明酶实际含量多少。一样重量酶，酶活力能够不一样，活力高，价值就大。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第3页2023/3/9(2)酶促反应速度酶活力详细用它所催化某一化学反应反应速度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T)酶催化反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶活力就愈低。所以测定酶活力(实质上就是酶定量)测定就是测定酶促反应速度(用v表示)。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物降低许或产物增加量来表示。单位：浓度/单位时间惯用产物增加量表示，因为它从无到有，改变显著。酶促反应随时间增加，产物增加。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第4页2023/3/9

若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应速度曲线。

Vmax时间产物生成量斜率＝浓度/时间＝V实验过氧化物酶活性的测专家讲座第5页2023/3/9从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，伴随反应时间延长，酶反应速度逐步下降。引发下降原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应进行，产物对酶有抑制作用等。所以研究酶反应速度以酶促反应初速度为准，即酶促反应最初一段时间，产物呈线性增加时反应速度。详细指酶促反应速度曲线斜率。即从原点对曲线作切线，求切线斜率(v)=浓度/时间实验过氧化物酶活性的测专家讲座第6页2023/3/9因为产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定。测定产物增加量方法很多：化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。物理方法：UV吸收、荧光等。同位素方法等。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第7页2023/3/9(3)酶活力单位表示酶活力大小，也就是酶量大小单位称酶活力单位(U)。国际单位(IU)定义：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔(µmol)底物酶量，或是转化1微摩尔底物中相关基团酶量。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第8页2023/3/93、测定原理过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类反应，产物为醌类化合物，此化合物深入缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深化合物。本试验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色4-邻甲氧基苯酚，其反应为：实验过氧化物酶活性的测专家讲座第9页2023/3/9本试验用紫外吸收法测定产物4－邻甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收-时间速度曲线，求出曲线斜率，即酶促反应初速度，再换算为酶活力。4实验过氧化物酶活性的测专家讲座第10页2023/3/921345678002

4

68反应时间

（分钟）生成物光吸收0.400.300.200.10实验过氧化物酶活性的测专家讲座第11页2023/3/92.pH对酶促反应速度影响(1)影响酶促反应速度原因*底物浓度米氏公式*温度*酶浓度*激活剂、抑制剂*pH实验过氧化物酶活性的测专家讲座第12页2023/3/9(2)pH对酶促反应速度影响大多数酶活力受其环境pH影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中一些基团解离，这些基团离子化状态关系到底物与酶结合、酶专一性和酶活性中心构象。通常各种酶只有在一定pH范围内才含有活性，并在一定pH下，酶促反应含有最大反应速度，此pH称最适pH，高于或低于此值反应速度都下降。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第13页2023/3/9如将反应速度对pH作曲线，经典呈钟罩形，但不一样酶受pH影响是不一样，所以会有不一样形状，有只有钟罩形二分之一，有则是一直线，即受pH影响不大。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第14页2023/3/9木瓜蛋白酶胃蛋白酶胆碱脂酶实验过氧化物酶活性的测专家讲座第15页2023/3/9不一样酶最适pH也不一样，如胃蛋白酶为pH1.5-2.5、胰蛋白酶为pH8。但应注意最适pH不是特征常数，对于同一个酶，其最适pH因底物种类、浓度及缓冲液成份不一样而有差异，所以酶最适pH并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。普通最适pH在6-8之间。因为酶活力受pH影响很大，所以在测定酶活力时，pH必须恒定，所以测活反应最好在缓冲液体系中进行。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第16页2023/3/9本试验测定三亇不一样pH下过氧化物酶时间－光吸收关系曲线，比较三亇不一样pH(6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力影响。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第17页2023/3/9三、试验操作1、过氧化物酶粗品液制备①称取红薯材料1g，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液（2ml左右)，于研钵中研磨成匀浆。②再加入3ml磷酸缓冲液浸提20分钟后，以6000r/min离心15分钟。③倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第18页2023/3/92、酶活力测定

(1)取1只比色杯洗净控干，按以下步骤操作：用移液管吸收0.1mol/L反应液(pH6.0)2.9mL加入比色杯中。放入紫外分光光度计比色杯架内，按autozero，出现插入空白，按ok，仪器自动调零。调零完成后按start，出现插入样品。(2)取出比色杯，1人加酶液(µL)，先加20µL，另1人同时按ok开始计时，加酶后盖上硫酸纸，按紧混匀，30秒内放入比色杯架内，仪器每30秒自动统计光吸收值A470nm。(3)按数据处理中数据打印，显示8个数据，统计数据。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第19页2023/3/9(4)操作关键点：*关键是酶稀释倍数和酶量多少要适当，使ΔA470nm在0.2~0.4/min，即第1个30秒A470nm在0.1-0.2。过低过高都应增加或降低酶量重新做。*加酶后应快速摇匀，马上计算时间，2人要配合好，计时不能提前或推后，不然曲线不是从原点开始。*每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水冲洗5遍以上，确保不残留上次溶液，不然影响测定。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第20页2023/3/9四.数据处理1.用坐标纸作出时间–A470nm曲线，过原点在直线部分作切线，求斜率ΔA470nm/min00.511.522.533.544.55

时间/min

10.80.60.40.2A470nm实验过氧化物酶活性的测专家讲座第21页2023/3/92.代入下式计算酶活力ΔA470nm/min·VPOD活力单位（μmol/min）=————————————ε·LΔA470nm/min·3mL=————————————26.6mL/µmolcm·cmΔA470nm×3=————————(μmol/min)26.6V反应液体积(mL)ε产物4—邻甲氧基苯酚摩尔消光系数26.6L/mmol·cm即26.6mL/µmol·cm)L比色杯光径(1cm)实验过氧化物酶活性的测专家讲座第22页2023/3/9试验三POD蛋白浓度测定和比活力计算

实验过氧化物酶活性的测专家讲座第23页2023/3/9一.试验目标1.学习Folin酚法（Lowry法）测定POD蛋白浓度原理和方法2.掌握比活力计算方法实验过氧化物酶活性的测专家讲座第24页2023/3/9二.试验原理1．Folin酚法原理Folin酚试剂由两种试剂组成：甲试剂：双缩脲试剂尿素加热至180℃左右，两分子尿素缩合放出一分子氨，而形成双缩脲。

实验过氧化物酶活性的测专家讲座第25页2023/3/9NH2

╱NH2

C=O╱╲C=ONH2180℃╲NH+NH3↑╱NH2C=O╱╲C=ONH2╲NH2实验过氧化物酶活性的测专家讲座第26页2023/3/9双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒石酸钾钠-CuSO4）络合生成复杂紫红色化合物。蛋白质分子中肽键（—CO—NH—）与双缩脲结构相同，也有双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，所以全部蛋白质或二肽以上多肽都有双缩脲反应，可用作蛋白质定性、定量分析。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第27页2023/3/9甲试剂实质是利用蛋白质中肽键反应进行定量测定，它与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，即受蛋白质氨基酸特异性影响较少。但灵敏度较低，mg级水平，0~10mg/mL作标准曲线。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第28页2023/3/9乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠（钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生。钼酸钠（钨酸钠）∣↓HCl

碱性

H3PO4+钼酸（钨酸）

磷钼酸钼兰（钨兰）（磷钨酸）还原剂

实验过氧化物酶活性的测专家讲座第29页2023/3/9

H3PO4+12H2MoO4→H3Mo12PO40+12H2O

碱性↓还原剂

Mo2O3•MoO3

兰色实验过氧化物酶活性的测专家讲座第30页2023/3/9

Folin酚试剂最初由Folin等于1912年提出，当初只有乙试剂应用于酚类测定，以后才用于蛋白质测定。因为Tyr酚基也能起还原剂作用，呈兰色反应，因而被利用于测定蛋白质，产物颜色深浅与被测蛋白质含量成正比关系，所以乙试剂作用是利用蛋白质中Tyr、Try、Cys等含有还原性氨基酸残基作用进行测定，灵敏度高，不过以后发觉有些缺点，出现不少改良方法。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第31页2023/3/91951年Lowry（劳里）在Folin酚试剂中引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为如今广泛被使用Lowry法。为何要作这么改良？Folin酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质中Tyr、Trp等氨基酸残基反应，而对于不一样种类蛋白质，因为它们之间氨基酸组成不一样，在呈色反应中就会有差异，影响试验准确度，即受蛋白质特征影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反应，不受氨基酸组成影响。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第32页2023/3/9引入双缩脲试剂后，含有两种试剂双重作用，相互补充，结果大大增加了反应灵敏度和准确度。Lowry法较双缩脲灵敏度提升100倍，较UV法灵敏10~20倍。Folin酚（Lowry）法，灵敏度高，操作简单，快速，不需要特殊仪器，惯用作蛋白质定量测定，文件引用最多。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第33页2023/3/9方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2～1.0mg/ml氮，误差为2％费时8～10小时蛋白质（平均含氮量16％）经过硫酸消化，强碱碱化，吸收并滴定，准确测定氮量非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低310nm比色0.1～1.0mg/ml540nm比色1～10mg/ml中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；一些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏0.1～1.0mg/ml快速5～10分钟蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基在280nm处光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液检测；核酸吸收能够校正Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高0.03～5g慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇花费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不一样蛋白质改变考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不一样蛋白质改变2、蛋白质定量测定实验过氧化物酶活性的测专家讲座第34页2023/3/93.比活力概念比较不一样重量或不一样蛋白含量酶活力并无实际意义，不一样酶或同一个酶在不一样情况下比较应有一个重量标准，于是产生出另一个酶主要参数——比活力。比活力指单位质量酶蛋白所含有酶活力单位酶活力单位/mg酶蛋白(IU/mg酶蛋白)比活力是酶学研究及酶制剂生产制备中经常使用数据，用来比较单位重量酶蛋白催化能力(即酶活力大小)。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第35页2023/3/9比活力实际意义能够说明酶质量好坏，纯度高低。不一样酶比较时，比活力高，说明其质量好，纯度高；对同一个酶，能够比较不一样批次质量和纯度。在酶生产制备过程，考查比活力尤为主要，伴随该酶不停被提纯，它比活力升高，说明酶逐步被纯化，比如，粗制品总活力很高，蛋白质含量也很高(杂蛋白多)，比活力低。纯化后即使总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白被除去而降低，使比活力升高。酶愈纯，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，所以比活力用以衡量生产工艺优劣、生产效率高低。它是一个很有实际用途参数，是经常要测定数据。实验过氧化物酶活性的测专家讲座第36页2023/3/9三、操作步骤

每人取16支试管，按下表平行操作：12345678标准蛋白质溶液/mL00.10.20.30.40.5——待测蛋白质溶液/mL——————0.030.05dH2O/mL0.50.40.30.20.100.470.45甲试剂/mL2.52.52.52.52.52.52.52.5混匀，于室温放置10min乙试剂/mL0.250.250.250.250.250.250.250.25快速混匀，室温放置30min后，以dH2O为空白，在640nm处比色A640nm(1)A640nm(2)A640nm

实验过氧化物酶活性的测专家讲座第37页2023/3/9*标准蛋白质溶液为牛血清清蛋白(150µg/mL)。*侍测样品x为POD酶原液，轻轻倒置摇匀后用注射器加50µL(0.050mL)，去离子水加0.450mL。

实验过氧化物酶活性的测专家讲座第38页2023/3/92.注意事项：*定量测定要求各种试剂量取准确，正确规范使用移液管。*乙试剂在酸性条件下稳定，而甲试剂在碱性条件下与蛋白质反应，生成碱性铜-蛋白质络合物溶液，所以在加入乙试剂后，应快速摇匀(