酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座

一、介绍蛋白质组成单位-氨基酸氨基酸结构通式

氨基酸（Aminoacid）赋予蛋白质特定分子结构形态，使他分子含有生化活性。蛋白质是生物体内主要活性分子，包含催化新陈代谢酵素和酶。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第1页按R基极性不一样来分类

酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第2页酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第3页汉字名称：丝氨酸英文名称：serine;Ser定义：学名：2-氨基-3羟基丙酸。一个脂肪族极性α氨基酸。L-丝氨酸是组成蛋白质常见20种氨基酸中一个，是哺乳动物非必需氨基酸，也是生酮氨基酸。在自然界中也有D-丝氨酸，如丝原蛋白中。在一些抗生素中也有D-丝氨酸。符号：S。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第4页丝氨酸是一个非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸新陈代谢及肌肉生长中发挥着作用，因为它有利于免疫血球素和抗体产生，维持健康免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜制造加工、肌肉组织和包围神经细胞鞘合成中都发挥着作用。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第5页氨基酸、多肽与蛋白质

酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第6页酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第7页一、目标：

学习并掌握纸层析法分离判定氨基酸原理和方法。二、原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物分配层析法，其中滤纸纤维上吸附水是固定相，展层用有机溶剂是流动相。在层析时，酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第8页将样品点在距滤纸一端约2～3cm某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸一个方向进行展层，这么混合氨基酸在两相中不停分配。因为分配系数（Kd）不一样，结果它们分布在滤纸不一样位置上。物质被分离后在纸层析图谱上位置，可用比移值（Rf）来表示。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第9页所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心距离（X）与原点至溶剂前沿距离（Y）比值。如图酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第10页酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第11页

在一定条件下（如温度、展层剂组成、层析纸质量等不变），某种物质Rf值是常数，所以可作为定性依据。因为氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本试验利用纸层析法分离氨基酸。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第12页三、试剂和器材：1.试剂：1.展层剂和平衡液正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液(弃去)。2.样品液用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸混合液(各4mg/ml)。3.茚三酮按展层剂0.25%百分比将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第13页试验器材1.层析缸2.点样毛细管3.小烧杯4.培养皿5.量筒6.喷雾器7.吹风机（或烘箱）8.层析滤纸9.直尺及铅笔酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第14页四、试验步骤1.准备滤纸：取宽约16cm、高约16cm层析滤纸一张。在纸下端距边缘2cm处用铅笔划一直线A，在直线上做5个记号，记号之间间隔2cm，标出5个点，这就是原点位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘直线B，在B线上以A、B两线交点为原点标明刻度（以厘米为单位）。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第15页2.点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散直径，最大不超出3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。3.层析：将平衡好滤纸，放入层析缸底部接触展层剂液面，展层剂不可浸没样点，展层剂抵达滤纸顶部边缘约0.5cm处停顿层析（层析时间2h左右）。然后取出层析滤纸，标好前沿，放入烘箱中45℃烘干。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第16页4．显色用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可，滤纸上即显出紫红色或黄色氨基酸斑点。5．计算各种氨基酸Rf值。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第17页五、注意事项在操作过程中，手不要摸滤纸。点样直径不超出3mm。点样一端朝下,扩展剂液面需低于点样线1cm。即时取出滤纸,以免出现氨基酸层析跑到滤纸外面不能检测。酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第18页

吸样后毛细管要垂直落在层析纸点样处，样点大小要基本一致；

样点不要浸在展开剂中；

喷显色剂时，使层析纸湿润即可，切勿流淌，并快速吹干；

在层析纸制作、点样、显色、吹干及值测定

等操作过程中，手只能拿在最上端，以防被手

沾污。

酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第19页六、思索题⑴层析纸上样品斑点浸在展开剂中是否能够？为何？⑵悬挂层析纸为何不能接触层析缸壁？酶促转化产物L丝氨酸的分析鉴定专家讲座第20页不能够。因展开剂会稀释、溶解样品，或