狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座

1.临床诊疗与试验室诊疗

试验室伎俩对狂犬病确实诊非常必要。ＷＨＯ要求狂犬病病例统计上报资料要注明诊疗依据（是否包含试验室诊疗？）。当前国际上公认狂犬病死亡率是100%，标准上不认可有狂犬病康复可能，即狂犬病发病率应与死亡率相等。没有合格试验室给出必定诊疗康复病例应从狂犬病病例统计数字中剔除。“狂犬病患者必死无疑，不死不算狂犬病”，要挑战这个命题，必须提供确切、完整病史和权威试验室诊疗资料。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第1页2.人狂犬病生存期内诊疗

生存期内诊疗技术选择主要伴随病程不一样而异。在病后最初几天，检测抗原普通是敏感。脑脊液及血清中病毒中和抗体经常趋向于在病后7—10天出现。检测抗原可用荧光抗体（FA）法检验狂犬病患者角膜印片或皮肤活组织，不过，FA阳性标本在发病后期更常见。皮肤活组织检验经常从颈背部取含有末稍神经带有毛囊标本。角膜印片(切勿划痕)取自伴有脑炎患者，用显微镜载波片轻轻触及角膜中心部位。角膜印片及皮肤活组织标本质量很主要，采取后应马上冷冻，直至检测。不过，用FA技术做生存期内诊疗，其敏感性是有限。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第2页

人狂犬病生存期内诊疗

已证实患者及自然感染和试验感染动物角膜印片中存在狂犬病抗原。不过，角膜印片检出率较低，阳性结果可必定是狂犬病，而阴性结果并不能排除是狂犬病可能。即使在临床症状开始时，在皮肤活组织中可能检出狂犬病抗原，但早期症状时仅有25-50%患者为阳性，伴随病情进展阳性率也增加。颈背部皮肤活组织检验只有一些患者呈阳性结果，尤其是在临床疾病早期。用FA检验皮肤活组织灵敏度普通高于检验角膜印片。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第3页3.动物和人狂犬病死后诊疗

抗原检测病毒分离病毒判定等。为了确保试验室结果可信性，必需满足若干条件：1.标本质量要好；2.标本送达试验室条件要好（符合GLP标准，取得一定级别资格认证）；3.取得结果等候时间要短；4.结果传递要快速。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第4页二狂犬病诊疗试验室安全办法1.危险性

在普通试验室条件，技术人员暴露于以下传染危险：——野生狂犬病毒(即街毒)，当试验室对接收到动物标本进行尸体解剖时或对标本进行加工时(悬液制备，离心)等，这一类操作是非常危险，必须在P3以上条件专业试验室中进行。——试验室适应病毒(即固定毒)，当接种试验动物或操作感染细胞培养时，尤其是制备大量高浓度病毒时，主要传染起源为手指被有感染玻璃或工具刺伤或割破；新糜烂皮肤或粘膜与感染物接触也应认为是一个传染危险。即使固定毒毒力已大为下降，历史上仅有一例死于固定毒操作报道，但仍有一定危险性，所以操作固定毒仍须十分小心。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第5页生物安全级别＆对工作人员要求

(BiologicalSafetyLevel,BSL)(Protection,P)

BSL-1：试验人员在试验程序方面受过特殊训练，由受过微生物学或相关科学普通训练科学工作者监督试验。

BSL-2：试验人员均接收过病源处理方面特殊培训，并由有资格科学工作者指导。

BSL-3：试验人员应在处理致病性和可能使人致死病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验、有资格科学工作者监督。

BSL-4：试验室组员应在处理尤其危险传染源方面受过特殊和全方面训练，应了解标准和特殊操作中一级和二级遏制作用、遏制设备、试验室设计性能。试验由在相关病源方面受过训练、并有工作经验、有资格科学工作者监督。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第6页2.对安全操作提议

操作全部潜在狂犬病感染材料均应在P2或P3生物安全试验室内进行。

对狂犬病试验室诊疗安全性要求：

①一个封闭环境，专作狂犬病感染性工作②经过缓冲更衣间并限制一定专业人员进入；③穿专用试验室隔离无菌衣和鞋；④操作完成对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应马上用3％雷苏尔溶液或其它对应消毒剂消毒)；⑤每日应最少消毒地板一次；⑥全部用后剩下标本，尸解工具，试验室材料在拿出试验室前应进行高压蒸气消毒。在生物安全柜或隔离器内打开动物颅盖骨操作很困难，技术人员在操作这项工作时应带面罩，护目镜、手套和围裙。因为与狂犬病相关病毒对人致病性还不很了解，全部操作可能含有这些病毒标本均应在生物安全柜内进行。全部试验室工作人员务必进行狂犬病疫苗暴露前免疫，这些人员中和抗体应定时检验，全部意外地暴露于感染时必需马上汇报责任人。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第7页三狂犬病毒抗原检测1.标本选择在选择、运输标本前，实际操作取得标本人员与试验室检测人员事先取得联络共同选择试验方法是很主要。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第8页1)标本取自个体生命期

Ａ．检验病毒和(或)抗原：样品应放在干燥试管内。样品获取可按下述方法进行。(1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮肤活检等样品。(2)角膜涂片，用显微镜载玻片直接接触角膜操作(不要用棉拭)，标识玻片，空气干燥并用铝锡纸单片包裹。Ｂ。检测抗体：血液、CSF或血清采集于干燥试管内，并低温冰冻存放。

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第9页2)标本取自死亡后个体

送至试验室标本方式依动物种类不一样而不一样。(1)小野生动物(包含蝙蝠)

送完整个体方便对动物品种进行准确判定。(2)家养食肉动物(狗、猫)或野生食肉动物

(狐狸、貉、浣熊、臭鼬、豺等)

仅送头部。(3)更大动物(家养或野生食草动物)

打开头盖骨并取脑送至试验室。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第10页标本取自死亡后个体（人）对人狂犬病在有可能进行全方面尸解时，把整个脑取出，或选择一些部位切下(海马角、脑干、皮质、小脑)送至试验室。在特殊情况下(困难野外条件，动物流行病学检测)以及因宗教或传统原因对狂犬病人无法尸解时，能够用塑料管或吸管穿进枕骨孔或眼窝后取出一些脑组织)。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第11页

2.标本运输

标本运输必需严格遵照安全要求，包装务必要有确保。1)

可靠诊疗要有一个保留良好标本；2)

运输狂犬病标本服务人员应事先进行过抗狂犬病免疫并证实已得到完全保护。3)小动物躯体或较大动物切下头部标本可用10％甲醛溶液处理过材料包裹，然后放入一个厚塑料袋内扎紧。如仅取脑(大动物)则应把脑放人一个坚固塑料或金属容器内并密封，标本作好标识，外加第二层包装并放人泡沫塑料盒中。远距离运输时可用干冰保冷。泡沫塑料盒用牢靠粘性带仔细封固；把全部相关标本资料放在信封内固定在盒上，再装进一个纸板箱内。箱上应清楚地标明“小心，有感染性生物材料，狂犬病诊疗用生物学标本”字样。当无冷冻条件且标本较小时，能够将小块脑组织放进装有80％甘油缓冲液小瓶内，以保留其感染性。在无需保留标本感染性，准备用免疫荧光法检测抗原时，则可将脑组织标本用10％甲醛固定(固定液内应含有苦味酸)。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第12页

3.标本获取1)动物脑组织获取1)将动物头部放在解剖台上用骨固定钳于上颁骨处牢牢靠定住，用尖锐屠刀从眼部至颅骨底部作一中线切割。然后将颞肌从颅部切除，颅盖骨用割刀和锤子等工具割掉。对大动物可用一外科骨锯在眼部二侧上方将头盖骨横切，切除脑膜，将髓质和脑神经切割后，即可将脑取出放在一纸盘或大平皿内。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第13页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第14页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第15页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第16页动物脑组织获取2)特异性病毒包涵体在脑一些部位更丰富，尤其是海马回，为了暴露海马回，从一脑半球后面约半球间沟外侧2cm处往下经过灰质和白质直到侧脑室作一纵切。海马角像二分之一园柱形闪光体从脑室底部凸出，小脑和脑干也富有病毒包涵体。当标本保留不好时，通常脑干，髓质和视神经还能保持完好。在常规操作中，采集海马角、一小块脑干和一小块皮质放在平皿内，在底部和上面标上标本序号。平皿马上放置于通风柜内处理或保留在4℃冷柜内。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第17页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第18页2)唾液腺获取为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻，两侧颌下腺位于颌骨后部边缘表面。在下颌下淋巴结后面（这二种不要相混同）。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第19页4.标本快速搜集技术在一些情况下可能难于或不可能尸解方便打开颅骨取脑,为降低这些困难已经设计出简便技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑组织体。第一个技术是用吸管经过枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，则吸管中脑组织内含有部分脑干，小脑，海马回和皮质。第二种技术为将吸管经过眼窝后壁(用套管穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、海马回、小脑。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第20页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第21页1)材料

①取样试管、塑料或玻璃吸管、套管。②保留或运输溶液：80％甘油PBS。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第22页2)方法

(1)枕部路径：①把动物颈部往前弯曲，切开枕部和第一颈椎间皮肤和肌肉；②割开寰椎一枕部韧带，打开关节；③将取样管经过枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有脑组织柱状体。

(2)后眼框路径：①将眼球推向一边，用套管在眼窝后壁穿孔；②将取样管插人推向颅骨后部对侧拔出，吸管内即含有脑组织柱状体。(3)脑柱体搜集：①用适当棉拭子或用橡皮球从管于清净端吹气将脑柱体从管子内推在平皿内；②如试验诊疗需延期进行则将脑柱体放进装有甘油溶液螺旋盖小瓶中。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第23页5.荧光抗体试验

FluorescentAntibodyTest(FAT)该方法特点是：——耗时短，整个FAT操作需30分钟，若加上涂片、固定，则需2-4小时。——与小鼠颅内接种试验MIT相比，符合率达99%。——需荧光显微镜及高质量荧光标识抗体。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第24页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第25页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第26页狂犬病毒抗原荧光标识抗狂犬病毒抗体免疫荧光试验检测狂犬病毒抗原狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第27页荧光抗体试验检测狂犬病毒抗原

FAT技术要求：——因为狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处，所以适当取样部位反抗原检测很主要。——脑样品印片必须用丙酮固定5-10分钟，因为丙酮可去除细胞膜表面脂类，方便抗体抵达细胞内与狂犬病毒结合。——脑样品必须保留在含50%甘油生理盐水中，印片染色前需用生理盐水洗涤数次。——荧光标识抗体需最大程度降低非特异性反应，所以制备特异性、高效价抗体是FAT关键。

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第28页荧光抗体试验检测狂犬病毒抗原操作要求：——印片不能太厚，不然易出现假阳性——一个切面最多可印4次，不然易出现假阴性——丙酮固定时间不宜太长——洗涤不宜过分——判读结果应快速，以免荧光淬灭狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第29页用抗狂犬病毒核蛋白

单克隆抗体制备荧光结合物我室当前采取抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体制备荧光结合物，经法国巴斯德研究所屡次试验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等动物起源样品，证实我们荧光抗体含有非特异性小、灵敏度高特点，质量上不比法国产品差。我们用该方法检测了我国广西狗肉市场上出售食用狗脑组织，结果发觉在154份外观健康犬中，有5份为狂犬病毒抗原阳性，而且经过乳鼠颅内接种，我们已分离到这5株狂犬病街毒株。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第30页6.快速狂犬病酶免疫诊疗法

RapidRabiesEnzymeImmunodetection(RREID抗狂犬病毒单抗狂犬病毒样品酶标抗狂犬病毒抗体狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第31页6.快速狂犬病酶免疫诊疗法

技术特点：——本试剂盒操作方便、快速灵敏，适于大量样本检测。——本试剂盒中酶标板包被后需马上使用或保留于-20C备用。——肉眼观察：阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。全部显黄色样品，不论深浅均认为是阳性。这种肉眼观察已足够作出诊疗，非常经济，因为不需要昂贵酶标仪，也最适合于作现场流行病学调查。——酶标仪读数：仔细擦净平板底面，用450nm滤光片读数。阳性对照光密度值（OD）必须大于1.0单位，阴性对照OD值须低于0.1单位，判定值（CUTOFF）确实定：阴性对照OD值0.008。OD值等于或大于CUTOFF标本均视为阳性。——福尔马林固定样品不宜作RREID。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第32页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第33页7.各种抗原检测方法比较：直接荧光抗体试验（FAT）:最大优点是快速、费用低且敏感性和特异性高。快速狂犬病酶免疫诊疗（RREID）试验:也是一个快速诊疗方法，有非常好敏感性和特异性；与FAT一样，即使标本运输条件不太好，也不会过多影响结果。RREID也与脑标本快速搜集方法相适应。细胞培养感染试验(RTCIT）:成神经细胞瘤细胞对ＲＶ非常敏感和特异。能在二十四小时以内得出结果，可替换小鼠分离病毒方法。但此法只适合在装备很好、工作人员受过很好训练试验室中进行。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第34页

四狂犬病毒分离和滴度测定

1.

小鼠颅内接种分离狂犬病毒法（MIT）：

——该方法敏感，适于不具备组织培养条件试验室分离狂犬病毒街毒。——耗时较长，仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒，需配合免疫荧光法作特异性判定。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第35页小鼠颅内接种分离狂犬病毒法4-6只小白鼠(9-11g重)样品，0.03ml/只4天后观察小鼠发病情况狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第36页细胞培养分离技术

Cell-cultureIsolationTechniques(CIT)——该方法敏感，配合免疫荧光法可进行特异性快速诊疗。——需在具备组织培养条件试验室中进行。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第37页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第38页狂犬病毒抗原检测与诊疗30%脑悬液样品，5000rmp，30minN2a细胞，继续培养24h后固定，加荧光标识抗狂犬病毒核蛋白抗体细胞无荧光，表明样品中不含狂犬病毒细胞有荧光，表明样品中含有狂犬病毒狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第39页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第40页胶体金免疫层析法检测狂犬病毒抗原

试纸有效性标志狂犬病毒阳性标志胶体金垫样品插入端狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第41页3.组织培养狂犬病毒快速滴定法待测RV样品经系列稀释后，分别感染96孔细胞培养板中BSR细胞。该细胞在感染RV后会在细胞质内形成大量包涵体，其主要成份为RVNP。感染二十四小时后，经抗RVNP荧光标识抗体特异性染色，可在荧光显微镜下观察到荧光灶（FF,FluorescenceFocus）。通常在低倍显微镜(160X)下检验8个视野。滴度用Reed&Muench方法计算，用荧光灶单位(FFU/ml)

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第42页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第43页2)结果我们将同一份CVS毒种分装保留于一70℃，在六个月时间内重复测定6次，其滴度相当稳定（对于病毒稀释度1：103.5，t=0.445，P>0.05；对于病毒稀释度1：104.2，t=0.353，P>0.05）。此CVS毒种在小鼠中毒力滴度为5.5LogLD50/ml(Sm=0.4LogLD50/ml),可用作毒力参考标准品。依据未知RV样品与此参考样品在组织培养中用荧光灶单位(FFU/ml)表示滴度比值，可直接换算出其在小鼠中LD50滴度。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第44页狂犬病毒抗原检测方法比较诊疗技术免疫荧光快速酶小鼠颅内细胞培养胶体金试验免疫诊疗接种分离技术免疫层析法所需时间2-3h3-4h5-10d20-24h5-10min特异性99.99%99.96%ND99.99%ND敏感性99.99%98.06%ND98.21%ND

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第45页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第46页狂犬病毒抗原检测与诊疗各种方法对广西狗肉市场狂犬病街毒检测结果样品例数MITRREIDIFAPCR（狗脑）阳性数阳性数阳性数阳性数1024*444*3份为狂躁型，1份为麻痹型狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第47页五灭活疫苗效价测定1.

改良抗体结合试验(ABT)在体外快速检测灭活狂犬病疫苗效力基本原理：

将定量RV中和抗体与系列稀释灭活狂犬病疫苗在试管中进行抗原抗体反应，疫苗中有效抗原成份会与对应中和抗体结合，即消耗掉部分(或全部)中和抗体。然后将剩下中和抗体用RFFIT方法在细胞培养中进行快速测定。疫苗中有效抗原成份含量越高，剩下中和抗体含量越低；经与已知效力疫苗标准品所作对照进行比较，即可推算出待测疫苗效价。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第48页改良抗体结合试验(ABT)

在体外快速检测灭活狂犬病疫苗效力实例：我们对6批灭活狂犬病疫苗用ABT方法测定4次，并与用NIH试验结果进行比较，两种方法所得结果差异均无显着意义(t＝1.39,P>0.05)，即这两种方法结果基本相符。ABT与NIH效力试验结果有很好相关性，而且愈加紧速、经济，重复性愈加好。该方法在大多数情况下可取代NIH效力试验。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第49页改良抗体结合试验(ABT)应用改良ABT相对于NIH试验有许多显著优点,在德国等国已作为常规方法，在狂犬病疫苗生产和科研中已普遍使用了约二十年，基本取代了NIH效力试验。此方法已载入WHO1996年版《狂犬病试验室技术手册》（第四版）。WHO推荐将此方法用于疫苗生产过程质量控制。不过在《欧洲药典》中，此方法仅是推荐用于RV糖蛋白浓度检测方法之一。当然RV糖蛋白浓度与疫苗效力直接相关。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第50页2.简化NIH小鼠试验法

简化NIH小鼠试验法标准上与传统NIH法没有区分。

此方法关键:将常规测定三个稀释度简化为一个稀释度，而且此稀释度只用10只小鼠。

此方法关键:正确选定稀释度。此稀释度应为假定该疫苗刚好到达2.5IU/剂最低合格要求时50％终点稀释度(即ED50,又称50%有效剂量)。按此稀释度接种10只小鼠，以有8只小鼠存活（得到保护）为合格标准。

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第51页稀释度计算公式此稀释度可由以下公式计算决定：

D=Dm+log10(n)-log10(N)–log10(v)其中，D＝待测疫苗最小ED50（用惯用对数表示）。Dm＝参考品疫苗平均ED50（用惯用对数表示）。n＝待测疫苗效力最低合格要求（IU/ml）。N＝参考品疫苗效力（IU/ml）。v=单剂待测疫苗体积(ml)国外文件上通常采取上述公式。如参考国内《规程》上表述方式（不用对数），则上式可改写为更直观形式：

D=(Dm×n)／(N×v)

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第52页稀释度计算举例：某参考品疫苗效力N=2IU/ml，其ED50平均值是16倍稀释，用惯用对数表示为1.2，即Dm=1.2；单剂待测疫苗体积v=2ml,对其效力最低合格要求是2.5IU/剂，所以n=2.5IU/2ml=1.25IU/ml。按公式计算：D=1.2+log10(1.25)-log10(2)–log10(2)=0.7100.7=5即ED50

为5倍稀释。如不用对数而直接计算，结果也相同：D=(16×1.25)／(2×2)=5。将待测疫苗按1:5稀释接种10只小鼠，试验结果如有8只以上小鼠存活，则表明该待测疫苗效力大于1.25IU/mlx2ml=2.5IU，即必定该待测疫苗到达最低合格要求。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第53页五狂犬病毒核酸检测

1．直接检测法：用已知互补于选定基因区一小段核酸序列作探针，进行直接分子杂交检测目标基因是否存在。

2．间接检测法：在进行分子杂交检测目标基因是否存在以前，事先对目标基因进行扩增，再作分子杂交检测。因为狂犬病毒转录和复制产生是RNA，所以扩增第一步必须将病毒RNA进行逆转录，成为互补链DNA，然后再将该DNA用多聚酶链反应(PCR)进行扩增。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第54页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第55页1.基因扩增(PCR)及检测

PCR技术于1990年首次用于检测狂犬病毒RNA，近几年来狂犬病毒分子流行病学研究进展都与该技术应用相关。对原始样品中微量病毒RNA经逆转录(RT)产生cDNA后，再经PCR进行放大。对放大产物可依据诊疗或分型不一样需要分别用不一样方法进行分析，如凝胶电泳、斑点杂交、限制性片段长度分析(RFLP)、直接测序等。与传统病毒分离或免疫学检测法相比，PCR在敏感性、特异性、尤其是在能提供准确序列资料等方面都要优越得多，所以有希望更广泛地用于狂犬病常规检测及分子流行病学研究。

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第56页PCR产物琼脂糖凝胶电流电泳图谱狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第57页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第58页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第59页RVPCR目标基因在选择RV基因组中目标基因时，为诊疗目标应选基因组上保守区。为分型及判别变异株应选易变区。

N基因:高度保守且大量转录，适合用于常规检测，可检出大样品中含量很低各种狂犬病毒。

L基因:其内若干区段也极稳定，但转录量较低，需采取尤其敏感检测方法。

G和L基因间间隔序列又称伪基因:是进化上某个蛋白编码基因残迹。它最易发生突变，更能代表病毒自然进化，是最好进化“时钟”。对伪基因比较尤其适合用于区分亲缘关系相近毒株。

G蛋白:是诱生中和抗体主要抗原且不如N蛋白稳定。N蛋白虽不能诱生中和抗体，但与免疫保护反应也有一定关系。为了解不一样毒株抗原特征和交叉保护分子基础，常需要对G基因和N基因进行序列比较分析。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第60页2.以基因扩增对狂犬病毒进行分型和起源判定以PCR为基础一个简便实用狂犬病毒分型方法是限制性片段长度多形性分析(RFLP)。比如，用3种限制性内切酶即能方便地判别基因1、4、5和6型：一套引物可使样品中N基因PCR产物为长约1．5Kb片段，对产物分别用3种限制酶消化：1)只有PstI选择性地切割6型(1个切点)；2)只有4型不被PvuI切割(其余均为1个切点)；3)DdeI可将1型切成2段，将5型切成多段。另一套覆盖G-L引物可经PCR放大在狂犬病毒及相关病毒中最多变伪基因，可用于对关系极近及极远毒株定型。对放大产物用5种限制酶可区分6种主要疫苗株(PV、ERA、SADB9、HEP、CVS和PM株)，并可与当前流行野毒株作比较。若用免疫学方法，需用8种抗N和6种抗G单抗才能完成一样判别任务。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第61页

狂犬病潜伏期到底能有多长？

PCR技术应用于狂犬病毒起源判定

一个精彩例证：

美国CDCSmith等对从美国3名狂犬病死者分离毒株判定。死者均为移民，其一移民时间已达6年。因为在美国感染狂犬病机会极少，而且PCR／序列分析结果直接证实分离株分别与死者起源国家狗中流行毒株相同，所以该作者以迄今最令人信服方式证实了狂犬病潜伏期可长达6年以上。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第62页3.狂犬病毒G基因序列测定和系统树进化分析

1981年Anilionist等报道了狂犬病毒G基因序列，随即几年里，又对几株狂犬病毒部分或全部基因进行测定。由此，经过序列分析，对各毒株之间相互关系有了深入了解，明确了狂犬病毒分类分子基础。逐步将狂犬病毒核酸、氨基酸序列与已知生物学和免疫学特征联络起来。能够推测或确定病毒抗原决定簇，和病毒致病力相关分子基础，以及病毒感染、复制和变异等主要功效性氨基酸区域。这对研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和复制有着主要指导作用，从而更有利于对狂犬病毒预防和和亚洲不一样地域、不一样起源RV街毒株Ｇ基因全序列，确定决定其毒力、免疫原性和致病性主要功效区，进行了序列系统进化比较分析，探讨我国及周连地域RV遗传变异规律。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第63页我所与法国巴斯德研究所

一项合作研究实例：

(1)RT-PCR及测序引物

参考文件和PV株序列，并用Oligo4.0软件进行校验，最终选取引物为：N（55-73）5’ATG-TAA-CAC-CTC-TAC-AAT-GG3’PA(3000-3019)5’TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC3’PB(4077-4096)5’ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG3’PC(3894-3913)5’GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC3’PD(5516-5536)5’GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG3’P15’CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT3’狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第64页(2)病毒RNA提取及RT-PCR于四日龄乳鼠脑内接种狂犬病病毒，注射量为0.02ml/只。待小鼠出现显著症状时，取脑进行荧光抗体检测（IFA）。对阳性鼠脑，采取TRIzol®Reagent(GIBCOBRL)提取总RNA。用N与PC为引物，采取AMVReverseTranscriptase(Promega)逆转录合成cDNA。在0.5mlEp管中依次加入35.5μl灭菌水、1μldNTP、5μl10×Buffer、3μlMgCl2、1μlPA(1ulPC)、1μlPB(1ulPD)、1μlcDNA，短暂离心后100℃水浴1min，再加入0.5μlDNA聚合酶，50μl液体石蜡，短暂离心后置于PCR仪：经94℃1min，58℃50s，72℃90s共循环40次，72℃保温10min后冷却至4℃。10000r/min离心5min后取下层水相转入1.5mlEp管，取5μl用于电泳判定，余下-20℃保留用于纯化。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第65页(3)产物纯化采取Wizaed®PCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega)纯化PCR产物。(4)电泳判定、cDNA序列测定取5μl未纯化产物或1μl纯化产物进行1.2%琼脂糖电泳。测序由大连宝生物有限企业完成。(5)序列分析序列比较排序采取CLUSTER以及GENEDOC软件处理。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第66页聚类分析(进化系统树构建)狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第67页2)结果和讨论：用计算机分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）开放读码框架（ORF），四株病毒G基因编码区均从起始密码ATG开始，除终止密码广西-4株为TAA外均为TGA，从ATG到终止密码全长共1575个核苷酸残基。(1)与其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性比较(2)狂犬病毒G基因不一样区段比较(3)疫苗评价(4)聚类分析(进化系统树构建)狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第68页五、狂犬病毒抗体检测

WHO狂犬病教授委员会认为大于或等于0.5IU/ml抗体水平表示能得到有效保护。1992年第八届WHO狂犬病教授委员会必定并推荐将小鼠中和试验(MNT)和RFFIT作为检测RV中和抗体两项基本方法，这两种方法应作为其它方法基准和参考。MNT是从上世纪30年代就开始采取经典方法。自上世纪70年代初开始，RFFIT逐步成为国际上最广泛接收对MNT替换方法。WHO教授委员会提议在可能时尽可能用RFFIT代替MNT，因前者更加快速、价廉，且灵敏度与MNT相同。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第69页小鼠中和试验

（Mouseneutralizingtest,MNT）

原理：

将一定量预先滴定好攻击病毒，与待滴定系列稀释血清孵育。试验中需设已知滴度参考血清。然后将病毒/血清混和物经脑内注射初成年小白鼠，计算死亡率和保护50%动物血清稀释度。

特点：——可定量检测狂犬病毒中和抗体效价。——需专门技术培训，操作较繁琐。——需14天出结果，耗时长，不利于快速诊疗。——需较多试验小鼠，成本高。——动物间个体差会影响试验结果。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第70页小鼠中和试验

三倍系列稀释待测血清预先滴定过中和用狂犬病毒（设已知国际单位标准血清对照）CVS鼠脑悬液（稀释成30-300LD50））

等量混合37℃保温1小时后

37℃中和1小时重复滴定LD50

颅内接种10-12克小白鼠

观察并统计小鼠发病及死亡情况

依据试验结果计算中和指数及中和抗体含量狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第71页2.快速荧光灶抑制试验

（RFFIT）

RapidFluorescentFocusInhibitionTest基本试验过程：

将固定剂量CVS病毒与系列稀释待测血清(包含已知滴度参考血清)一起在96孔细胞培养板中温育(体外中和反应)。病毒最适剂量在预试验中预先确定，为经二十四小时温育后能使80%细胞感染(产生荧光包含体)最高稀释度。中和反应结束后在每孔中加入等量敏感细胞(BSR)悬液。再经二十四小时温育后,细胞单层用丙酮固定,用荧光标识抗NP抗体染色,以检测未被中和病毒存在(荧光灶FFU)。与病毒对照组比较,计算每种待测血清使固定量CVS病毒FFU/ml降低50%稀释度，然后与已知滴度参考血清比较，计算每种待测血清中和抗体滴度。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第72页快速荧光灶抑制试验三倍系列稀释待测血清预先滴定过中和用狂犬病毒（设已知国际单位标准血清对照）CVS病毒悬液（稀释成30-100FFD50））

等量混合37℃保温1小时后

37℃中和1小时复滴定TCID50

接种96孔已形成单层BSR细胞

CO2孵箱37℃培养24小时

固定并用荧光抗体染色，荧光镜观察，统计每孔荧光灶数量，计算血清抗体效价狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第73页狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第74页

病毒最适攻击量确实定：

二十四小时能使80%细胞被感染最高稀释度。

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第75页MNT和RFFIT检测RV中和抗体含量变异范围：

MNT：67%~149%

RFFIT：68%~146%

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第76页MNT和RFFIT

检测2种抗RV血清参考品结果

参考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）

A13.414.0

20.219.5

12.713.9

15.518.0

（GMT）15.216.2

B40.552.2

70.042.2

52.360.0

66.247.3

（GMT）56.050.0狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第77页微量RFFIT方法建立我所在八年前已开始建立起微量RFFIT方法，并对该方法重复性、特异性和灵敏度与MNT进行了比较，共检测了数百份人畜血清样品。该方法有希望在狂犬病临床诊疗、疫苗质量控制和流行病学调查等项工作中取得广泛应用。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第78页A.试验方法1)攻击病毒制备和滴定：(1)通常采取毒株为固定狂犬病毒CVS株,在BHK/BSR细胞中制备。(2)细胞上清分装安瓶,储存在-80℃。(3)最适攻击剂量为二十四小时温育后能使80%细胞感染(产生荧光包含体)最高病毒稀释度(预试验确定，参见前述组织培养狂犬病毒快速滴定法)。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第79页2)血清病毒中和反应：(1)待检血清经56℃30分钟灭活。(2)在96孔板上设置“未感染细胞对照”和“病毒对照”孔。(3)每个血清稀释度设2个孔。(4)除病毒对照孔外,每个孔加入100lD-MEM培养基。(5)直接在孔中进行待检血清和参考血清系列3倍稀释:(每孔已加入100l培养基)将50l血清加入第一排孔,依次从1/3到1/81稀释。在“病毒对照”孔,加入100l培养基。(6)在含稀释血清每个孔内,加入50l预先滴定病毒悬液。在“未感染细胞对照”孔内,加入50l培养基。在“病毒对照孔”,对病毒悬液进行4次2倍稀释,从1/2到1/16。(7)在37℃5%恒湿温箱中保温1小时。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第80页3)加入细胞：(1)用胰酶消化细胞,制备浓度为1x106细胞/ml细胞悬液.每孔加入50l细胞悬液(5x104细胞)。(2)在37℃5%CO2恒湿温箱中温育二十四小时。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第81页

4)固定和染色：

(1)用与盛有漂白粉溶液大瓶相连真空装置抽吸去各孔中上清液。(2)用PBS浸泡各孔3次,每次5分钟(抽吸上清液)。(3)以80%丙酮浸洗各孔,重复一次(在-20’C放置5分钟)。抽干各孔,空气干燥。(4)每孔加入40l抗NP抗体荧光结合物(预先1:20)稀释),在37’C湿盒中保温30分钟。(5)吸出结合物,以PBS洗2次，第一次1分钟,第二次5分钟。(6)空气干燥,每孔加1滴甘油。(7)萤光显微镜下观察。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第82页

B.结果观察1)统计每孔萤光数(FF)。2)与病毒对照组比较,对每种待测血清计算FF数降低50%稀释度。3)与参考血清比较,计算每种待测血清滴度。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第83页

C.计算实例:

血清X1/27:15%参考血清:10IU/ml1/81:20%1/81:60%1/243:70%

(50-15)/(60-15)xLog3+Log27(50-20)/(70-20)xLog3+Log81=0.371+1.4314=1.80=0.286+1.9=2.194101.8=63102.194=156.5X/10=63/156.5X=4.03IU/ml狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第84页用MNT和RFFIT测定2种抗RV中和血清参考品结果

参考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）

A13.414.0

20.219.5

12.713.9

15.518.0

（GMT）15.216.2

B40.552.2

70.042.2

52.360.0

66.247.3

（GMT）56.050.0狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第85页RFFIT特点：——可定量检测狂犬病毒中和抗体效价。——耗时较短，可用于准确定量快速诊疗。——重复性好。——需专门技术培训，操作较繁琐。——需荧光显微镜。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第86页3.酶免疫吸附法（ELISA）：酶免疫吸附法是七十年代建立方法，当前世界上用于检测狂犬病毒抗体酶免疫法基本上是采取间接ELISA法，其吸附抗原有全病毒颗粒、纯化狂犬病毒糖蛋白以及纯化狂犬病毒核衣壳蛋白（RNP），并以过氧化物酶标识抗抗体作为标识抗体，即可检测人及不一样动物血清中抗狂犬病毒抗体。狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第87页各种检测狂犬病毒抗体ELISA法抗原抗体比较酶免疫吸附法吸附抗原所检测抗体间接ELISA纯化狂犬病毒糖蛋白抗狂犬病毒糖蛋白抗体（中和抗体）间接ELISA纯化全病毒颗粒抗狂犬病毒抗体（含中和抗体）间接ELISA粗制狂犬病毒抗吸附抗原抗体（含中和抗体）间接ELISA纯化狂犬病毒核衣壳蛋白抗狂犬病毒核衣壳蛋白夹心间接ELISA狂犬病毒抗原抗狂犬病毒抗原抗体（含中和抗体）

狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第88页酶免疫吸附法抗狂犬病毒单抗包被狂犬病毒抗原待检人血清中抗狂犬病毒抗体酶标抗人IgG抗体显色底物狂犬病的实验室检测与诊断技术专家讲座第89页ELISA特点：——ELISA只需简单试验室设备，尤其适合检测大量血清样品，且在很短时间内即可出结果。——ELISA法与MNT有很好相关性，在小鼠喂养及