蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座

蛋白质双向电泳及质谱技术蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第1页蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第2页双向电泳介绍2-DE是当前唯一个能够仅经过一次操作解析上千种蛋白质技术。第一向—等点聚焦(IEF)pH梯度载体pI第二向—十二烷基硫酸钠(SDS) SDS作为变性剂和助溶剂分子量蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第3页样品等点聚焦(第一向)双向电泳基本原理与流程示意分子量pH梯度(pI)SDS两性电解质pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第4页双向电泳详细步骤样品制备缓冲液配制IPG条重泡涨及上样第一向：IEFIPG条平衡平衡缓冲液Ⅰ(还原)平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)第二向：SDS胶条染色成像及图像分析蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第5页为何要进行样品制备当前双向电泳普通只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中蛋白种类可到达10万种以上。待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究通常是单一细胞类型。？蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第6页1确保样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰原因少尽可能使全部待分析蛋白样品全部处于溶解状态（包含多数疏水性蛋白）。防止样品制备过程中发生样品抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中核酸和一些干扰蛋白。尽可能去除起干扰作用高丰度或无关蛋白，从而确保待研究蛋白可检测性。经过超离心去除全部颗粒状物质，预防其堵塞凝胶孔路。2最大程度降低样品损失低温保留样品(普通需低于-86℃)尽可能缩短处理时间除盐，省略无须要过程确保样品在聚焦时不发生蛋白聚集和沉淀。样品制备标准蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第7页样品制备流程及注意事项溶解预处理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分级富集除杂蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第8页样品破碎标准－最小程度降低蛋白水解和其它形式蛋白降解样品起源易碎细胞坚硬组织植物细胞真菌方法温和猛烈蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第9页温和破碎法渗透压冲击(培养细胞)低渗液中悬浮细胞重复冻融法(细菌)液氮冷冻去污剂降解(酵母、霉菌)降解缓冲液(含尿素和去污剂)SDS(应在IEF前往除)酶降解(植物、细菌、真菌)溶菌酶(细菌)纤维素酶，果胶酶(植物)溶壁酶(酵母)蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第10页猛烈破碎法超声破碎(细胞悬浮液)需以冰凉却防止过热弗式细胞压碎器(Frenchpressurecell，带壁微生物细胞在剪切力作用下破碎研磨(固体组织，微生物)液氮中将固体组织磨成细粉末样品研磨器(用于少许样品处理)用于准确样品珠磨法(胞悬液，微生物)经过磨珠研磨破坏细胞壁蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第11页作用去除杂质浓缩样品抑制蛋白酶活性关键-可溶性取得能够重新溶解蛋白惯用方法硫酸铵沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸铵/甲醇/苯酚抽提样品沉淀

对于疏水性尤其强蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱)蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第12页样品中杂质去除去除标准尽可能不丢失蛋白降低蛋白修饰杂质主要种类DNA/RNA脂质多糖盐离子去污剂其它固体杂质

蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第13页DNA/RNA去除样品中含核酸不利影响能被银染色法染色在凝胶酸性部分产生水平条纹当样品抵达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase处理超声(机械破坏)、超高速离心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第14页其它杂质去除脂质使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH盐使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮离子去污剂如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦丙酮沉淀；将含SDS蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，TritonX-100，NP-40等缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%固体杂质阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦过滤蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第15页样品溶解2-DE成功分离蛋白质最关键原因之一溶解目标样品中非共价结合蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽溶解液（不然样品中结合牢靠蛋白复合物可能使2-DE中出现新蛋白点，对应表示单个多肽点强度会下降）溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离盐、脂类、多糖和核酸等物质去除溶解方法要确保样品在电泳过程中保持溶解状态蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第16页增加样品溶解性伎俩变性剂改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性剂溶解疏水基团离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等还原剂使变性蛋白深入伸展溶解含自由巯基DTT或-巯基乙醇，不带电荷磷酸三丁酯(TPB)起载体作用两性电解质抵达平衡位置形成pH梯度，“运载”电流、pH捕捉样品中少许盐分浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF速度降低)蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第17页样品液准备标准液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液0.0002%溴酚蓝见下表0.2%两性电解质载体385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量试剂蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第18页IPG

用两亲性电解液组成250l25l20%8-10125l12.5l40%7-97-10250l25l40%5-85-8125l12.5l40%4-6250l25l40%3-53-6125l12.5l40%5-7125l12.5l40%4-64-7250l25l40%3-103-10样品溶液体积(/5ml)样品溶液体积(/5ml)两亲性电解液浓度(w/v)两亲性电解液范围IPG胶pH范围蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第19页样品制备注意事项

蛋白质水解低温Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质蛋白抑制剂特殊样品制备低丰度蛋白分离预分级窄pH胶(<2个pH单位)强碱性蛋白(如核糖体)处理预处理富集特殊pH梯度IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦极端分子量蛋白处理小于8kD对流混合，产生绒毛状或含糊带大于200kD蛋白，变性为多肽蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第20页梯度器塑料支持膜固定pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)胶条制备ACBFED酸碱

pH3pH10蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第21页固定pH梯度(IPG)示意图聚丙烯酰胺凝胶CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺单体酸缓冲基团：碱缓冲基团：NH3+R

蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第22页宽pH梯度及窄pH梯度宽pH梯度用于：

全部蛋白(确定感兴趣蛋白大致位置)窄pH梯度用于：

提升分辨率增加载样能力以检测、分析更多蛋白

蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第23页IPG胶重泡涨及上样2-DE样品重泡涨溶液重泡涨溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG缓冲液

(两亲性电解液)0.28%DTT微量

溴酚蓝IPG胶条支架IPG

胶条定位泡涨目标：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第24页蛋白载样量IPG胶条对蛋白载样量影响原因：待分析蛋白点量应满足随即质谱分析待研究蛋白丰度样品复杂度复杂度较高样品，为了尽可能了解所包含每种蛋白，需要重复试验才能完成。假如将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条pH范围预试验确定先宽后窄先线性后非线性先短后长蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第25页第一向：等点聚焦1.放置电极垫

(?)2.200V

维持

1.5h3.500V维持

1.5h

4.1000V梯度上升

1500vh5.8000V梯度上升

(?)36000vh时间电压支架盖IPG

胶条电极电极垫蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第26页IPG

胶条平衡

平衡液6M尿素和30%甘油降低电内渗第一步平衡加DTT使变性非烷基化蛋白处于还原状态第二步平衡加碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，预防其在电泳过程中重新氧化蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第27页

使被分离蛋白质与SDS完整结合第二向:SDS

SDS平衡SDSSDS平衡液50mMTris-HCl6M尿素30%丙三醇2%SDS微量

溴酚蓝SDSSDSSDS向电泳缓冲液中加

0.5%琼脂糖SDS标识纸片IPG胶条蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第28页胶体考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍可实现PAGE无背景染色会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析结果胺基黑染色转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上蛋白质染色转印至硝酸纤维素膜上蛋白质染色银染可降低胶内蛋白质产量对一些种类蛋白质染色效果差对其后蛋白质测序和质谱分析造成影响染色方法蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第29页银染色50%甲醇25%乙酸4hddH2O洗3次30min/次0.004%DTT溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30sec3%Na2CO30.0185%甲醛2.3M柠檬酸5%乙酸25%甲醇蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第30页负染主要包含金属盐染料、锌－咪唑染料等使用能专门提升PAGE胶上蛋白质回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白质生物活性不能用于膜上染色适合用于蛋白质显色、完整蛋白质胶上被动提取以及质谱分析胶体扩散染料主要包含印度墨水染料、胶体金属染料等高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上蛋白质灵敏度与PAGE胶内银染类似不用于胶内染色染色方法蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第31页有机荧光团染料包含共价结合和非共价结合荧光团染料两类，后者最为惯用，其经典代表是已经商品化SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来判定蛋白质金属螯合染料与当代蛋白质组学研究相兼容专门与惯用微量化学表征过程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很轻易和集成化蛋白质组学平台（包含自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合染色方法蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第32页凝胶图像处理分析经典流程凝胶图像扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库建立2-DE分离可溶性

E.coli蛋白蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第33页当前双向电泳需处理问题样品制备及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白)难分离蛋白(如毛发及皮肤中蛋白)载样量提升初步分离低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白定量分析灵敏度及可重复性蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第34页对于双向电泳提议首先采取宽pH范围胶条，确定蛋白分布范围，通常采取pH3-10胶条假如pH线性分布胶条分离效果不好，可采取非线性胶条加大蛋白上样量，提升局部蛋白分辨率采取窄pH范围胶条，提升某pH范围蛋白分辨率第二向采取梯度胶进行分离去除高丰度蛋白，进行蛋白分级处理，富集低丰度蛋白蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第35页蛋白质质谱技术蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第36页质谱基础

样品离子源质量分析器离子检测器固体液体蒸汽形成离子(带电分子)电离质量分选(过滤)检测依据m/z分选离子数据处理质谱检测离子基本步骤:1.样品离子化2.依据质量(m/z)不一样分离离子3.检测每种质量离子数目4.搜集、处理数据得到质谱图蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第37页质谱评价指标质量范围速度灵敏度分辨率准确度蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第38页+++自由漂移区检测器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针激光335nmm/z相对强度MH+MH+MH+特点：灵敏度高准确度高分辨率高质量范围广图谱简明速度快蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第39页ESI四级杆质量分析器碰撞室反射器MCP检测器碰撞气体串联质谱法(MS/MS)ESI-Q-TOF质谱仪步骤：1质量分析

2碰撞(离子裂解)3质量分析TOF质量分析器蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第40页强抗背景干扰能力极高检测灵敏度和准确度可用来分析复杂混合物中蛋白质丰富检测信息，高通量判别蛋白质串联质谱优点蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第41页1、判定和注释蛋白质路线

经过肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配经过串联质谱进行单个或多个蛋白质判定鸟枪法蛋白质组学蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第42页

1234.5396

783.9147375.2561多肽已测得质谱数据或理论质谱数据MALDI-TOF检测多肽指纹

胰酶消化凝胶蛋白质数据库?123比较:??是否相同

??质谱3235.2256蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第43页

肽质谱指纹图在数据库中匹配

不成功可能原因样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻数据质量不好。2-DE胶上所取一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质混合图。蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第44页

操作中角蛋白或其它蛋白质污染蛋白质发生了较多转译后修饰，数据库中未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多未知新蛋白质数据库规模太小续：蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第45页氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白质数据库？查询串联质谱图从头测序输入输出序列片段PNT①②③串联质谱判定多肽计量方法蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第46页组织切片或印片原位质谱分析技术两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换盘旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）联合技术准确判定蛋白质蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第47页2、基于生物质谱定量蛋白质组研究策略

原理：对于含有相同离子化能力蛋白质或多肽，能够经过比较质谱峰强度（或峰面积）得到待比较蛋白质相对量。

蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第48页3、基于质谱蛋白质相互作用研究方法靶蛋白制备蛋白质复合体纯化蛋白质复合体质谱判定基本步骤：蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第49页(1)亲和层析耦联质谱技术

基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用蛋白质细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上蛋白质，最终用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）判定靶蛋白结合蛋白。蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第50页先决条件得到足够多保持生物活性重组靶蛋白作为诱饵（bait）

取得足够量、纯度高与诱饵相互作用蛋白质蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第51页利用含靶蛋白融合蛋白取得

相互作用蛋白质谷胱甘肽S转移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第52页主要优点

灵敏度高：高浓度靶蛋白候选蛋白质与靶蛋白结合机会均等检测多亚基蛋白质之间相互作用蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第53页(2)免疫共沉淀耦联质谱技术

原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱判定靶蛋白结合蛋白。

蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第54页研究鼻咽癌细胞系中p53相互作用蛋白抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀SDS分离免疫沉淀复合物切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到对应肽序列标签搜索数据库蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座第55页特点

生理条