对川楝内生真菌进行形态学鉴定,微生物论文

对川楝内生真菌进行形态学鉴定,微生物论文川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.是楝科〔Meliacease〕楝属MeliaLinn.的落叶乔木，主要分布于四川、贵州、云南，主要有效成分为川楝素〔toosendanin，C3OH38O11〕，有驱虫、抗癌、抗毒素等作用。川楝固然分布广泛，但川楝素的产量却较低，而药用植物内生菌能够产生与宿主一样或类似的天然活性物质，如苦楝素、鬼臼毒素类似物。聚酮类化合物〔polyketide，PK〕与非核糖多肽〔nonribosonmalpeptide，NRP〕是2类具有代表性的天然产物，可用作抗生素、抗真菌剂、抗癌药物、免疫制剂、抗病毒药物等。催化这些天然产物合成途径的酶称为聚酮合成酶〔polyketidesynthase，PKS〕和非核糖体多肽合成酶〔nonribosonmalpeptidesynthetase，NRPS〕。已有研究发现，禾本科植物内生真菌中存在NRPS，番荔枝AnnonasquamosaL.内生真菌中存在PKS。但是当前对药用植物内生真菌PKS和NRPS的研究相对较少。传统真菌的鉴定以形态、生化等表型特征为基础，经过复杂，同时不产孢菌株用此方式方法鉴定较为困难。而分子生物学的发展为真菌的鉴定提供了更全面、科学的根据。ITS序列在核苷酸序列上的高度变异性和长度上的保守型，能够获得足够的信息来反映真菌种水平间的差异，当前已应用于药用植物内生真菌的鉴定。本研究对川楝内生真菌进行了形态学鉴定，通过PCR扩增其ITS序列、PKS和NRPS基因，进行BLAST比拟和系统发育分析，以期了解川楝内生真菌的遗传多样性，为川楝内生真菌资源的开发利用提供根据，同时丰富PKS和NRPS基因数据库。1、材料采集四川省雅安市、攀枝花市、宜宾市、广元市、成都市、乐山市、西昌市、绵阳市、达州市9个地点，经四川农业大学胡超讲师鉴定为川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.的根、茎、叶、皮、果，从分离得到了126株内生真菌，经去重和限制性片段长度多态性〔restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP〕分析后选取39株多样性明显的菌株作为本研究的目的菌株。2、方式方法2.1内生真菌表型鉴定用PDA培养基对39株菌株进行插片培养，观察菌落特征和显微形态特征，参照魏景超=的方式方法将其鉴定到属。2.2内生真菌总DNA的提取采用改进的CTAB法提取川楝内生真菌的DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和大小，置于?20℃保存备用。2.3ITS-PCR扩增ITS-PCR扩增所用引物为ITS1〔5-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3〕和ITS4〔5-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3〕由上海生工合成。ITS-PCR扩增的反响体系〔30L〕：2PCRMix15L，ITS1〔10pmol〕1L，ITS4〔10pmol〕1L，DNA1L，无菌重蒸水补足至30L。反响程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，产物于4℃恒温保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。2.4PKS基因的扩增PKS基因扩增所用引物为KAF〔5-GARKSICAYGGIACIGGIAC-3〕、KAR1〔5-C-CAYTGIGCICCRTGICCIGARAA-3〕和KAR2〔5-CCAYTGIGCICCYTGICCIGTRAA-3〕由上海生工合成。PKS扩增的反响体系〔30L〕：2PCRMix15L，KAF〔10pmol〕1L，KAR1或KAR2〔10pmol〕1L，DNA2L，无菌重蒸水补足至30L。反响程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，产物于4℃恒温保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。2.5NRPS基因的扩增NRPS基因扩增所用引物为AUG003〔5-CCGGCACCACCGGNAARCCHAA-3〕和AUG007〔5-CCGGACCATGTCGCCNGTBYKRT-A-3〕由上海生工合成。NRPS扩增的反响体系〔30L〕：2PCRMix15L，AUG003〔10pmol〕1L，AUG007〔10pmol〕1L，DNA2L，无菌重蒸水补足至30L。反响程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，产物于4℃恒温保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。2.6测序及序列分析将ITS的产物和得到的PKS、NRPS基因片段直接送华大基因科技有限公司测序。将所得序列在GenBank中进行BLAST同源性检索，将获得的同源序列和测定序列用ClustalX进行分析，采用MEGA5.0软件包中的Kimura-2-ParameterDistance模型进行多序列匹配，用邻接法〔Neighbor-joining,NJ〕构建系统发育树，Bootstrap1000次检测各分支的置信值。将所测的序列提交到GenBank数据库，获得登录号。3、结果与分析3.1川楝内生真菌的鉴定本实验共分离得到126株内生真菌，经初步去重和限制性片段多态性分析后选择39株为代表菌株进行进一步分析，见表1。经过表型鉴定〔部分菌株的表型见图1〕，能够鉴定到属的内生真菌菌株为31株，分属于17个属。部分菌株由于未产孢而没有鉴定到属。它们分别为青霉属PenicilliumLk.exFrise、木霉属TrichodermaPers.exFR.、曲霉属AspergillusMicheliexFr.、交链孢属AlternariaNeesexWallr.、黑葱花霉属PericoniaTodeexSchw.、附球菌属EpicoccumLk.exWallr.、镰孢霉属FusariumLk.exFr.、枝顶孢霉属AcremoniumLk.exFr.、多节孢属NodulisporiumPress、肉座菌属HypocreaFr.、毛壳菌属ChaetomiumKunzeetSchmidt、脉纹孢菌属NeurosporaShearetDodge、拟茎点霉属PhomopsisSacc.、芽枝霉属CladosporiumLinkexFr.、节孢霉属ArthriniumKunze、茎点菌属PhomaSacc.和短梗蠕孢霉属TrichocladiumHarz。3.2川楝内生真菌的系统发育分析川楝内生真菌菌株DNA用引物ITS1和ITS4扩增得到的PCR产物，大小在500～600bp〔图2〕。通过用BLAST在Genbank数据库序列比照分析发现，川楝内生真菌种群构造具有非常丰富的资源多样性。在本研究中，序列类似性最低的为SCAU-F-210，与相似性最高的Periconiamacrospinosa相似性仅为86%；产孢〔SCAU-F-182〕与Botryotiniafuckeliana类似性最高，为100%。系统发育树〔图3〕显示，川楝内生真菌分属于短梗蠕孢霉属、微壳色单隔孢属MicrodiplodiaAll.、青霉属、交链孢属、脉纹孢菌属、附球霉属、新丛赤壳科属NeonectriaWollenw.、曲霉属、芽枝霉属、拟茎点霉属、木霉属、茎点霉属、NeofusicoccumparvumCrous、黑葱花霉属、镰孢霉属、毛霉属MucorMicheliexFries、节孢霉属、毛壳菌属、皱赤壳属RugonectriaP.ChaverrietSamuels、多节孢属、肉座菌属、鹿角菌属XylariaHillexGrev.、葡萄孢盘菌属BotryotiniaWhetzel、枝顶孢霉属和炭垫属NemaniaS.F.Gray25个属。所得39个序列中有7个序列归属于曲霉属〔17.9%〕，6个归属于青霉属〔15.4%〕，为川楝内生真菌的优势属。3.3PKS基因的分析部分菌株的PKS基因扩增电泳图见图4，由图可见产物条带在600bp左右。共得到12个PKS基因片段，占总量的30.8%。将测序得到的PKS基因片段用BLAST比对，结果见表2。本研究得到的PKS片段与GenBank中已经知道PKS序列的类似度较高，从99%～100%。本研究中得到的PKS基因均为I型的PKS。PKS基因的系统发育树〔图5〕显示，它们分属于曲霉属、交链孢属、镰孢霉属、葡孢盘菌属，华而不实有7个为曲霉属。3.4NRPS基因的分析菌株的NRPS基因扩增电泳图见图6，由图可见产物条带在700bp左右。本研究共得到了6个NRPS基因片段，占总量的15.4%。将测序得到的NRPS基因片段用BLAST比对，结果见表3。本研究得到的NRPS片段与GenBank中已经知道NRPS序列的类似度很高，从99%～100%。得到的6个NRPS基因的类似序列都为Penicilliumsp.，因而NRPS的系统发育树省略。4、讨论研究发现，药用植物具有非常丰富的内生真菌资源。而楝科植物内生真菌的研究主要集中在苦楝M.azedarachL.和印楝AzadirachtaindicaA.Juss上，本研究弥补了对川楝内生真菌研究的缺乏。Geris等从巴西苦楝分离出55株内生真菌，分属于8个属，青霉属和曲霉属是最多的。陈远友等从安徽农大校园等地苦楝分离出了290株，分属于11个属，华而不实匐柄霉属StemphyliumWallr.、交链孢属、刺盘孢属ColletotrichumCorda和拟茎点霉属是优势属。邵士成等从云南印楝分离出372株，分属于50个属，分布广泛的是刺盘孢属、交链孢属、鹿角菌属。Verma等从印度印楝中分离出了233株，分属于18个属，拟茎点霉属、枝孢霉属、拟盘多毛孢属PestalotiopsisSteys.为优势属。本研究对川楝内生真菌的形态学鉴定和系统发育分析表示清楚，川楝内生真菌分属于25个属，青霉属、曲霉属为优势属，可能植物种类和地理位置对内生真菌的资源多样性、优势种群有很大的影响。其他研究人员对川楝和印楝内生真菌的研究大多采取形态学鉴定的方式方法，而本研究采取形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方式方法，弥补了不产孢菌株鉴定的缺乏，使川楝内生真菌的资源多样性较为完好，同时也证明了ITS结果的可靠性。但是，由于数据库还不够完善，有的菌株并没有鉴定到种。川楝内生真菌在资源的多样性上为寻找产生生物活性物质的菌株奠定了基础。研究人员已经从印楝和苦楝的内生真菌中发现了多种生物活性物质。Geris等从苦楝内生真菌青霉属分离得到了有抑菌活性的3个化合物。Campos等从苦楝内生真菌AspergillusaculeatusIizuka中初次分离到2个聚酮类化合物。Yang等从苦楝内生真菌Fusariumsp.LN-10发酵产物中分离得到了有较强的海虾致死活性的化合物。本研究从川楝内生真菌中挑选出了12株含PKS基因的菌株和6株含NRPS基因的菌株，这些菌株从属于青霉属、曲霉属、葡孢盘菌属、交链孢属、镰孢霉属。本研究从6株青霉属菌株中挑选出了NRPS基因，7株曲霉属菌株中挑选出了PKS基因，表示清楚川楝的内生真菌还是有开掘潜力的，华而不实青霉属和曲霉属值得深切进入研究。以下为参考文献：[1]国家中医药管理局(中华本草〕编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1998.[2]张建楼,钟秀会.川楝素的药理作用研究大概情况[J].上海畜牧兽医通讯,2007(5):65-67.[3]StierleA,StrobelG,StierleD.TaxolandtaxaneproductionbyTaxomycesandreanae,anendophyticfungusofPacificyew[J].Science,1993,260(5105):214-216.[4]王琪,傅育红,高锦明,等.苦楝内生真菌的初步分离和挑选[J].西北农业学报,2007,16(2):224-227.[5]曾绍荣,邵华,张玲琪.从南方荷叶中分离出一株产鬼臼毒素类似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