TCALAS 110-2021 实验动物 人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范

ICS65.020.30B44中国实验动物学会团体标准T/CALAS110-2021实验动物

人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范Laboratoryanimal—Specificationofpatient-derivedxenograftmousemodels2022-01-10 发布 2022-01-10实施中国实验动物学会 发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：西安交通大学、空军军医大学、南昌大学。本文件主要起草人：刘恩岐、薛莹、师长宏、何远桥、王维蓉、张海、赵四海、白亮。鏈鏈鏈鏈实验动物 人源肿瘤异种移植小鼠模制备技术规范范围（patient-derivedxenograft，PDX）模型PDX包括临床标本选择与处理、模型质量控制、应用研究和信息化管理等。PDXPDX使用过程。规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14922.1《实验动物寄生虫等级与监测》GB14922.2《实验动物微生物等级与监测》GB14925《实验动物环境及设施》GB/T14926.55《实验动物免疫酶组织化学法》GB19489 《实验室 生物安全通用要求》GB/T35823 《实验动物 动物实验通用要求GB/T35892 《实验动物 福利伦理审查指南术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1人源肿瘤异种移植PDX（一般指小鼠体内形成的移植瘤模型。3.2传代passage肿瘤在动物体内生长到一定程度后，从其体内取出肿瘤组织并移植到新的免疫缺陷动物体内的过程，称为PDX模型的传代。106106中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）3.3实体瘤solidtumor临床影像检查（如X线、CT、B超等）或触诊扪及的有形肿瘤组织。3.4非实体瘤non-solidtumor临床影像检查（如X线、CT、B超等）以及触诊无法看到或扪及的肿瘤。例如，白血病属于非实体瘤。3.5荷瘤小鼠tumor-bearingmicePDX的免疫缺陷小鼠。3.6免疫缺陷动物immunodeficiencyanimal由先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺失的动物。3.7裸小鼠nudemouse由于Foxn1基因发生突变而形成，无毛、缺乏正常胸腺，T淋巴细胞生成障碍，应用广泛。3.8SCID小鼠T3.9NOD-SCID小鼠Prkdc突变基因导入非肥胖糖尿病背景小鼠（non-obesitydiabetes，NOD）体内获得。PrkdcT淋巴细胞、B淋巴细胞的正常发育，NOD-SCIDT淋巴细胞、B淋巴细胞功能缺陷，NK细胞功能和补体结合能力也下降。3.10重度联合免疫缺陷小鼠是在NOD-SCID背景下，IL-2受体γ链（IL2rγ）缺失而形成的重度联合免疫功能缺陷实验动物实验动物人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范 107T淋巴细胞、BNK种移植模型的良好宿主动物。常见重度联合免疫缺陷小鼠品系有：（.CgcsdgtSg/icCl）（.csdgt1jl/Sz）（hpPkdc22g6d2/p）（OPrkdcsdIL2rgt1Bcge）（.Cgcsdgt1）M-NSG（NOD-PrkdcscidIl2rgem1/Smoc）等生物安全风险评估PDXGB19489信息，需要进行风险评估，确定其生物安全危害及开展实验的环境要求。动物模型选择选择原则PDXSPF需求，选择不同品系小鼠移植。PDX模型免疫缺陷小鼠品系PDXSCIDNOD-SCID小鼠以及重度联合免疫缺陷小鼠等。PDX模型的小鼠的年龄、性别4～12小鼠性别，如乳腺癌一般选择雌性小鼠，前列腺癌一般选择雄性小鼠。模型小鼠饲养环境PDX模型小鼠均使用SPF级免疫缺陷动物，即在屏障环境中用独立通气笼具（individualventilation装置或隔离器内饲养。饮用高压灭菌水或酸化水，使用Co60或电子束照射后的饲料。进入屏障环境的材料均通过高压灭菌或物理化学方法进行辐射、消毒。定期开展饲养环境监测，确保免疫缺陷动物身体健康。肿瘤样本选择与前处理患者肿瘤样本选择在符合医学伦理学规范和《中华人民共和国人类遗传资源管理条例》前提下，根据科108108中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）学研究需要、肿瘤分型、肿瘤特征、实验条件、外科手术或活检取材方式等进行选择。肿瘤样本前处理2℃～8集管，封口后在管壁标记好患者信息，将采集管放入冰包中低温条件下（2℃～8结冰）1mm～3mm肿瘤样本保存PDX适当保存，以备鉴定和药物评价。病理保存30固定的组织进行脱水包埋处理。样本冻存将肿瘤组织块修剪后，放入含有冻存液的无菌冻存管内，采用冻存体系或程序降温盒冻存。冻存体系：4℃、15min→0℃、30min～2h→80℃过夜，液氮长期保存。PDX模型制作模型制作环境和生物安全防护操作人员应在生物安全二级或以上级别生物安全实验室或相应级别生物安全柜中进行操作人员进行相对应级别的更严格的防护。皮下接种麻醉小鼠，接种部位备皮，用乙醇和碘伏消毒。将移植肿瘤组织块放入套管针中，一般接种在皮下血供丰富的双侧肩胛区。将接种后的小鼠置于温暖环境清醒后正常饲养。注意需将手术后的小鼠和未手术小鼠分开放置、饲养。手术接种信息须进行详细记录。肾包膜下接种以侧卧位肋下切口为例。麻醉、备皮后，将小鼠侧面位放置，用乙醇和碘伏消毒，切开表皮、肌肉，暴露肾，用小刀片或其他利器轻轻划开肾包膜，用镊子将肿瘤组织块放置进去，将肾复位，缝合好肌肉和表皮。将接种后的小鼠放置于温暖环境中，待小鼠清醒后实验动物实验动物人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范 109正常饲养。注意需将手术后的小鼠和未手术小鼠分开放置、饲养。手术接种信息须进行详细记录。原位接种根据患者肿瘤发生的部位，对应接种在小鼠体内相应部位。常见的原位接种肿瘤有：胶质瘤、乳腺癌、胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。注意需将手术后的小鼠和未手术小鼠分开放置、饲养。手术接种信息须进行详细记录。操作后的清理（10%84消毒液等（10min，然后将其放置在生物危害废物或尖锐容器处置器皿中，由专业机构处理。PDX模型观测、传代、取材及安乐死模型观测小鼠PDX模型制作成功后，定期（每周不少于一次）测量小鼠体重和肿瘤大小。皮下接种模型可用游标卡尺测量接种肿瘤大小。肿瘤大小计算公式：V=π/6×L×W2V=1/2×L×W2。其中，V表示肿瘤体积；L表示肿瘤长边长度；W表示肿瘤短边长度。肾包膜和原位肿瘤接种模型，可应用影像学方法观测接种肿瘤大小。模型传代1000mm3～1500mm3PDX组织冻存。PDXP0P0PDXP1代，以此类推。模型取材实体瘤根据造模方式不同，分别取肿瘤和荷瘤脏器，非实体瘤采集血液或其他体液。移植瘤剖检将荷瘤小鼠麻醉，局部皮肤消毒，切开皮肤，取出肿瘤，用生理盐水或磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，PBS）冲洗干净，观察测量并在有标尺的背景下拍照记录。原位肿瘤模型的脏器剖检PBS观察测量并在有标尺的背景下拍照记录。110110中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）安乐死15c如果动物的肿瘤生长方式限制了它们的活动能力，阻碍了它们获取食物和水，动物表现出嗜睡、呼吸困难、不活动、毛发皱缩、体温下降、食欲不振等现象或者接种肿瘤处皮肤显示出坏死的症状，也应对其实施安乐死。PDX模型鉴定为了保证PDX模型肿瘤与最初取材的患者肿瘤病理特征一致，需要进行鉴定。模型病理鉴定组织病理学鉴定：苏木精-伊红染色（hematoxylinandeosin，H-E染色）和免疫组化染色。模型分子生物学鉴定短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR）分型检测、聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）、全外显子组测序（wholeexomesequencing，WES）、基因芯片、单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）、比较基因组杂交（comparativegenomehybridization，CGH）分析等。影像学检测PDXBCT细胞学鉴定对于非实体瘤的血液类肿瘤，主要通过细胞学技术判断造模情况。PDX模型制备成功判定标准病理学H-E染色观察模型肿瘤组织与患者肿瘤组织形态相同，免疫组化染色判断具有相同的肿瘤标志物。分子生物学STR或PCR法等进行肿瘤组织溯源性检测，证明模型的肿瘤是人源性而非鼠源性。细胞学细胞学技术判定非实体瘤类肿瘤。实验动物实验动物人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范 111其他方法辅助判定前文所述的其他鉴定方法。PDX模型信息化管理临床临床患者临床患者的必要信息患者住院号、年龄、性别、疾病诊断、患者知情同意书、输血前四项（乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒）。临床患者的补充信息患者种族/民族、目前治疗药物和措施、患者治疗史及必要的微生物检查。临床肿瘤包括肿瘤分类、分型、解剖位置和肿瘤组织病理学等相关信息。临床肿瘤的必要信息肿瘤编号、肿瘤发展阶段（如原发、转移、复发）、组织病理学、肿瘤等级分类、疾病分期分类、特定肿瘤诊断标志物以及是否来源于未经治疗的患者等。临床肿瘤的补充信息（PDX模型。模型建立模型建立的必要信息PDX（如组织或细胞悬液（原位等）、研究单位伦理批件、实验动物管理委员会批件。模型建立的补充信息肿瘤移植成功率、药物反应、肿瘤生长曲线等。模型质量控制根据患者肿瘤的关键特征，获取关于传代肿瘤组织来源等全面、可靠信息。模型质量控制的必要信息组织病理学、免疫组化染色，评估人类肿瘤标志物、STR分型等。模型质量控制的补充信息PCRDNADNAPDX肿瘤生长对标准治疗的反应、动物健康状况监测、PDX模型功能性评估等。112112中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）模型研究和其他相关数据模型研究PDX模型的研究方向和内容。其他补充信息：治疗、治疗控制（如剂量、细节）、治疗反应、肿瘤组学信息、样本编号、取样位置、人源或鼠源、所用技术等。PDX模型相关的数据库建立PDX相关数据库及数据存储和使用规范。实验动物实验动物人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范 113附 录 A（资料性附录）试剂配方A.1 样本运输保存液配方：基础培养基（DMEM/F12、DMEM高糖、RPMI1640等）+2%～3%（青链霉素混合液3%～5%B、万古霉素。A.2 RPMI16404