a淀粉酶的固体发酵技术

a淀粉酶的固体发酵技术第1页/共26页

霉菌а-淀粉酶大多采用固体曲法生产；细菌а-淀粉酶则以液体深层发酵为主。固体培养法以麸皮为主要原料，酌量添加米糠或豆饼的碱水浸提液，以补充氮源。在相对湿度90%以上，曲霉用32-35℃培养36-48h，立刻在40℃下烘干或风干，即成工业生产用粗酶。

第2页/共26页米曲霉固体培养法生产а-淀粉酶工艺流程：润水粉碎熟料厚层通风制曲烘干粗酶制剂抽提蒸煮过滤烘干压滤沉淀原料

成品种曲原菌斜面试管培养纯种三角瓶培养种曲培养粉碎第3页/共26页包括内容：原料的粉碎、润水及蒸煮三方面的内容目的：使蛋白质达到适度变性，淀粉充分糊化，以利于微生物的生长繁殖和代谢。处理方法：粉碎机粉碎或过筛，要求粒度为2-3mm为宜，大小均匀。一、原料的处理第4页/共26页原料的选择：

麸皮40-50%（提供微生物生长繁殖需要） 稻壳20-30%（改善工业培养的通风性、补充营养源）

CaCO31%（用于调节pH值,酶激活剂） 水30-40%第5页/共26页蒸煮的目的使蛋白质适度变性形成变性蛋白和少量氨基易被微生物分解；促进淀粉糊化成糊精和寡聚糖。杀菌功能，利于菌体生长。第6页/共26页高压旋转蒸煮锅（有假底式）高压旋转蒸煮锅（有假底式）

第7页/共26页高压旋转蒸煮锅（无假底式）

第8页/共26页蒸煮技术要求：①普通法：0.12Mpa，15-30min②高短法：0.18-0.2Mpa，3-5min。③淀粉充分糊化，蛋白消化率78%以上。熟料的要求：呈浅淡的黄褐色，有香味及弹性，无浮水，无硬心，不粘，无其他不良气味，水分含量为46%-50%（因季节而异），消化率在78%以上。第9页/共26页（一）菌种的选择

由于不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种产生а-淀粉酶的能力已经是原有野生菌种的数倍或数十倍。目前，我国常采用的霉菌为米曲霉612或2120。它具有遗传性能稳定，不产生有毒代谢产物，生产周期短，酶活性高等特点。二、种曲的制备第10页/共26页（二）、菌种扩大培养1、斜面试管培养将原菌种接入米曲汁或麦芽汁琼脂斜面培养基，经过32-34℃，70-72h试管培养，待菌丝布满斜面，并着生黄绿色的孢子即已成熟，可作为下一步培养的种菌或在低温下（0-4℃）储藏备用，每3个月转接一次。第11页/共26页2.纯种三角瓶种子培养（1）培养基：25g麦麸，5g玉米粉及30mL水，加HCl三滴，搅拌后装入500ml三角瓶中，包扎后120℃灭菌30min，冷却，备用。（2）接种量：每支斜面试管菌种接种三角瓶培养基5-6支。（3）培养：接种后将三角瓶置于32-34℃下培养，约18h后，菌丝体发白结饼，此时应摇瓶，打碎结饼。再过4h，菌丝体再次发白结饼，再次摇瓶。培养18h后，应将其倾斜放置，并注意摇瓶，直至长满均匀一致的黄绿色孢子，即可作为三角瓶种子，冷藏备用。第12页/共26页3、种曲培养：（1）、设备：种曲室，曲盘、草帘、纱布等

（2）、灭菌常用灭菌剂方法一：KMnO4：甲醛=1：2熏蒸（注意用氨水收）方法二：硫磺：甲醛=2.5：1加热熏蒸（注意控制，防止着火）。用量以甲醛10g/m3空气量进行计算。第13页/共26页（3）、培养方法：（3天曲法）接入量为0.5-1.0%，料层厚1cm左右为宜直立式堆叠曲房保温28-30℃培养，干湿相差1°16h培养当品温达到34℃左右时，曲料面层稍有发白及结快时，进行第一次翻曲。十字堆叠室温继续保持在28-30℃，翻曲后4-6h，品温可达到36℃左右，在进行第二次翻曲，注意保持水分3天后，种曲成熟，麦麸上布满黄绿色孢子。既为种曲。第14页/共26页（4）、种曲质量检验A镜检孢子数法：显微镜直接观察种曲稀释液中的孢子数。要求≥25-30亿个/g种曲（湿基计）B摇落孢子数法：称取10g种曲，烘干后摇落其孢子（用75目筛

D=0.2mm），求干孢子与干物质的百分数，一般要求在18%左右。C发芽率测定法：利用悬滴培养法。要求发芽率≥90%。PROTEIN&ENZYMEENGINEERING1、外观检验

孢子旺盛，呈新鲜的黄绿色，具有种曲特有的曲香，无夹心，无根霉、青霉等其他杂色。

2、孢子数测定菌悬液无菌水溶液培养基第15页/共26页三、厚层通风制曲厚层通风制曲：就是将曲料置于曲池内，其厚度为25-30cm，利用通风机供给空气及调节温度，从而促进米曲霉迅速生长繁殖。1、制曲设备

大小：10～12×8×3m为宜①曲室（空调箱）结构：保温，双层门，弧形顶，天窗

第16页/共26页②曲池：大小：8～10×2×0.6-0.8m为宜

③通风机：目前常采用的是中压型通风机（H100﹤300mm汞柱）。通风量一曲池内物料重量的4-5倍m3空气量/h为宜。第17页/共26页④翻曲机及曲铲（双转式）2、冷却及接种原料拌匀，蒸煮后冷却至30℃，接种量0.5%，拌匀入池。第18页/共26页3、制曲工艺

霉菌生长规律工艺流程铲曲曲料入池孢子发芽期静止培养菌丝生长期通风培养菌丝繁殖期第二次翻曲第一次翻曲

孢子着生期（淀粉酶分泌最旺盛）成曲第19页/共26页4、制曲不当常出现的问题酸曲

原因：曲料水分过高或通风不良使产酸菌如小球菌、粪链球菌生长繁殖，PH值降低。防治方法：降低曲料水分，加强通风。花曲

原因：种曲不纯或制曲过程污染而形成防治方法：检查种曲纯度，加强制曲管理或更换菌株。烧曲

原因：制曲过程种温度过高。米曲霉最适生长温度32-35℃，超过38℃易使菌体死亡。防治方法：加强制曲，注意温度控制。第20页/共26页5、厚层通风制曲的操作要点

“一熟、二大、三低、四均匀”

一熟：原料要熟透。二大：即大风、大水。熟料水分要求在60%以上，风量70～80m3/min。三低：装池料温要低，制曲品温要低，进风风温低。四均匀：原料混合和润水要均匀；接种要均匀；装池疏松度要均匀；料层厚薄要均匀。第21页/共26页6、烘干

目前常采用40℃低温烘干或风干法降低水分，储存备用或直接采用水或稀食盐水溶液进行浸提，再用乙醇沉淀或硫酸铵盐析，酶泥滤出后经调配烘干即成成品。第22页/共26页7、粗酶曲料的质量指标感官鉴定颜色：主要为孢子的着色。应为黄褐色，颜色过深或孢子过多，说明曲子太老，酶活性会降低。松软度：松散柔软，润滑不扎手，无硬块，弹之即散。香气：有枣香气，无酸味及不良气味。第23页/共26页理化鉴定a-淀粉酶活性根据液化能力（测定黏度的下降）和糊化能力（测定碘反应的消失）来测定，后者较为普遍。我国目前测定a-淀粉酶使用的两种测定方法方法一：以60℃一