ch细胞工程的基本技术

ch细胞工程的基本技术第1页/共42页一、常用洗涤剂1.铬酸洗液（重铬酸钾－硫酸洗液，或简称洗液）成分强酸溶液中酸溶液弱酸溶液重铬酸钾/g63120100浓硫酸/ml1000200100蒸馏水/ml2002001000注意事项在蒸馏水中缓慢加入浓硫酸，加热的同时分次加入磨碎的重铬酸钾至其完全溶解重铬酸钾加蒸馏水后加热溶解，冷却后再缓慢加入浓硫酸第2页/共42页2.浓盐酸：可洗去水垢或某些无机盐沉淀3.5％草酸溶液：用数滴硫酸酸化，可洗去高锰酸钾的痕迹4.5％～10％乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪器内壁的白色沉淀5.尿素洗涤液：为蛋白质的良好溶剂，适用于盛蛋白质制剂及血样的容器6.有机溶剂：丙酮、乙醇、乙醚等可用于洗脱油脂、脂溶性染料等的污迹第3页/共42页第4页/共42页二、玻璃器皿的洗涤初次使用附有游离的碱性物质清洗方法：1%盐酸浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1～2次，干燥后即可使用第5页/共42页已使用过的试管、烧杯、三角瓶：现将器皿中的残渣除去，用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次吸管、滴管、移液管：先放入铬酸洗涤液中浸泡2h以上，取出后经流水冲洗0.5h左右，再用蒸馏水冲洗1～2次，晾干备用载玻片、盖玻片：先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几个小时或用稀铬酸洗涤液煮沸0.5h，取出后清水冲洗干净，储藏于95％的酒精中备用第6页/共42页其他沾过传染性样品或污染的容器，应先进行高压灭菌后再进行清洗盛过各种有毒药品，特别是剧毒药品和放射性同位素物质的容器，必须经过专门处理，确知没有残余毒物存在方可进行清洗

危险！第7页/共42页三、塑料用品的洗涤用合成洗涤剂洗涤，并反复冲洗多次，最后用蒸馏水冲洗或：2%NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，2％～5%HCl浸泡30min，再用自来水和蒸馏水依次冲洗第8页/共42页三、橡胶制品的洗涤新购置胶塞、胶管等：先用0.5mol/LNaOH煮沸15min，然后流水冲洗，再用0.5mol/LHCl煮沸15min，流水冲洗，自来水煮沸两次，最后用蒸馏水煮沸20min，50℃烘干备用（除去胶塞上的滑石粉等有毒物质）用过的胶塞可按玻璃器材的方法清洗第9页/共42页四、金属器械的洗涤新的金属器械常涂有防锈油，可先用沾有汽油的纱布擦去，再用自来水和蒸馏水洗净，最后用酒精棉棉球擦拭晾干使用过的：用自来水和蒸馏水洗净，再用酒精棉球擦拭晾干第10页/共42页Section2常用灭菌方法及原理

第11页/共42页根据对微生物的杀灭程度，杀菌可分为3个等级：灭菌、消毒和防腐灭菌：彻底杀菌，杀灭一切微生物的营养体及芽孢和孢子消毒：非彻底杀菌，消灭病原菌和有害微生物的营养体，但不能杀死全部芽孢或孢子防腐：抑菌过程，防止或抑制微生物的生长繁殖消毒、灭菌与防腐的区别第12页/共42页一、热力灭菌热力灭菌：利用高温杀死微生物的方法原理：当高温作用于微生物细胞时，首先引起微生物细胞内原生质的变性、酶结构的破坏，从而使细胞失去了生活机能上的协调，停止生长发育；随着高温的继续作用，细胞内原生质便发生凝固、新陈代谢活动停止，细胞死亡第13页/共42页不同微生物对高温的抵抗力不同，同一种微生物的不同生理状态对高温的耐受力也不同热力灭菌的杀菌指数热死温度：10min内可以杀死细菌悬液中所有细胞的温度热死速度：在一定温度下，杀死所有细胞所需要的时间第14页/共42页⑴湿热灭菌利用蒸汽或沸水灭菌称为湿热灭菌湿热穿透力强，蛋白质、原生质胶体在湿热情况下易变性凝固常用湿热灭菌方法：高压蒸汽灭菌法常压蒸汽灭菌法间歇灭菌法煮沸消毒法巴氏消毒法第15页/共42页①高压蒸汽灭菌法灭菌效果好、试用面广，是实验室最常用的灭菌方法使用仪器：高压蒸汽灭菌锅注意事项灭菌锅内冷空气必须排尽（缓慢排气法和集中排气法）灭菌锅内的物品必须排列疏松，使蒸汽畅通灭菌完毕应缓慢降压注意棉塞防湿灭菌时间依容器的体积及培养基的多少而定第16页/共42页第17页/共42页②常压蒸汽灭菌法采用自然压力的蒸汽进行灭菌的方法使用仪器：阿诺氏（Arnold）流通蒸汽灭菌器或普通蒸笼流通蒸汽的温度一般为100℃左右（要杀死耐热性的芽孢一般需6～8h）优点：容量大、结构简单、成本低廉、可自行建造缺点：灭菌时间长、能源消耗大，稍不注意就有灭菌不彻底的现象发生第18页/共42页③间歇灭菌法间歇一定时间连续消毒几次达到灭菌目的的方法每次灭菌条件为100℃、20～30min，杀死其中的营养体灭菌后置灭菌物品于室温或温箱中约24h，使芽孢萌发成营养体，再次灭菌时被杀死适用于某些不耐高温的物品和培养基灭菌第19页/共42页⑵干热灭菌采用灼烧或干热空气灭菌的方法虽然干燥高热空气的穿透力不如湿热蒸汽强，但它使用方便，故广泛使用于实验室和生产实践常用干热灭菌方法：火焰灭菌法干热灭菌法第20页/共42页①火焰灭菌法通过火焰高温灼烧进行灭菌的方法接种环、接种针、剪刀、镊子等金属工具通过火焰灼烧可彻底灭菌试管口、玻璃瓶口等通过几次火焰，温度可达200℃以上，可杀死一切微生物和芽孢第21页/共42页②干热灭菌法利用加热的高温空气进行灭菌的方法烘箱是干热灭菌的常用仪器适用于玻璃器皿和金属器械等物品的灭菌，不适用于液体材料和含水份的培养基等材料的灭菌160℃～180℃维持40min，或120℃灭菌2h玻璃器皿放入烘箱前必须完全干燥，以免引起破裂；灭菌温度要缓慢上升，灭菌后待温度下降到60℃下才能开箱门第22页/共42页二、辐射灭菌辐射是通过波动或粒子在空间高速运行而传达能量的一种物理现象，利用辐射产生的能量进行杀菌的方法，称为辐射灭菌辐射可分电离辐射和非电离辐射两种α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线、中子和质子等属电离辐射紫外线、日光为非电离辐射第23页/共42页⑴电离辐射灭菌α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线等波长极短，辐射能很大，可将被照射物质原子核周围的电子击出，使其变为阳离子，击出的电子可附着在其它原子上，使其变成阴离子，也可以再冲击其它原子，引起继发电离在液体中，射线使水电离成H＋和OH－，它们是强烈的氧化剂和还原剂，可直接作用于微生物细胞本身，致使微生物死亡第24页/共42页在微生物周围环境中的液体内，经常有氧存在→离子与氧分子结合→过氧化物（强氧化性）→微生物细胞中的蛋白质、酶等氧化变性→细胞受到损伤而死亡在一定的范围内射线的杀菌作用与剂量成正比射线对微生物的杀菌作用，与微生物所处的环境条件和微生物的类型及生理状态有关，一般芽孢比营养体耐电离辐射，干燥状态比液体中耐辐射，无氧比有氧下耐辐射，培养基中有还原剂比无还原剂耐辐射第25页/共42页辐射灭菌不使物品升温，而且穿透力强，可直接对密封包装的物品进行灭菌适用于处理量大且不适合高压或过滤等方法消毒的培养用品培养工作中和临床上所用的多种一次性器械和物品，如培养瓶（皿）、培养板、注射器、移液器吸头、离心管等电离辐射需要专门的设备和专业人员操作第26页/共42页⑵紫外线（UV）杀菌通过直接破坏微生物的核酸和蛋白质等使其灭活，以及间接通过UV照射产生的臭氧杀死微生物紫外线波长范围在180-380nm间，最具杀菌力的波长范围在250-260nm间，尤以254nm附近最强紫外线穿透力很弱，一层普通玻璃或水均能滤去大量的紫外线，因此紫外线只适用于空气和物体表面的消毒第27页/共42页三、过滤除菌通过机械性阻留微生物而达到无菌要求；选用过滤器0.22μm孔径，可以完全除菌适用范围：不能高温灭菌的溶液（如维生素、酶液、血清等）设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器优点：不破坏溶液中的生物活性物质，不产生有害物质缺点：只适用少量滤液；需大量无菌空气以及净化工作台第28页/共42页四、化学杀菌利用化学药剂进行杀菌或抑菌之方法常用化学药剂种类重金属盐类氧化性消毒剂还原性消毒剂表面活性消毒剂抗生素第29页/共42页⑴重金属盐类所有的重金属盐类对微生物都有毒害作用，如汞、银、铅、锌、铜等，微生物浸在0.1～0.5%硝酸银（AgNO3）、升汞（HgCl2）等溶液中，几分钟就会死亡原理：重金属离子带正电，容易与带负电的菌体蛋白结合，使其凝固变性低浓度重金属离子与酶或某些活性物质的活性基团（如巯基）结合，使酶失活，对微生物起到杀死或抑制的作用第30页/共42页低浓度重金属离子可与酶或某些活性物质的活性基团（如巯基）结合，使酶失活，对微生物起到杀死或抑制的作用第31页/共42页⑵氧化性消毒剂原理：通过强烈的氧化作用破坏微生物的原生质或酶蛋白的结构常用的氧化剂有高锰酸钾、过氧化氢、臭氧、过氧乙酸、漂白粉等高锰酸钾、过氧化氢常用的浓度为1%；过氧乙酸为0.2-0.5%；漂白粉为0.5-1.2%第32页/共42页⑶还原性消毒剂甲醛是常用的还原性消毒剂，能与微生物细胞蛋白质的氨基结合，引起蛋白质变性作为商品的福尔马林为37-40%的甲醛溶液，5%的福尔马林溶液常用于防腐和种子表面消毒，可杀死细菌芽孢和真菌孢子常用于培养室、接种室的熏蒸灭菌（100ml甲醛加5g高锰酸钾为一个使用单位，每20m2放置一个剂量单位）第33页/共42页⑷表面活性消毒剂乙醇、石炭酸（苯酚）、来苏水（煤酚皂溶液）、新洁尔灭等为常用表面活性消毒剂乙醇能降低表面张力，改变细胞膜的渗透性及原生质的结构状态，使蛋白质凝固变性乙醇具有浸润和灭菌的双重作用石炭酸及其衍生物也使蛋白质凝固变性，损伤微生物细胞壁和质膜，常用1％～2%酚液新洁尔灭（化学名称十二烷基溴化胺）能破坏细胞膜的渗透性第34页/共42页⑸抗生素常用双抗（青霉素、链霉素）、卡那霉素加入到培养基中，终浓度为：青霉素—100单位/mL培养基链霉素—100μg/mL培养基卡那霉素—50μg/mL培养基第35页/共42页Section3无菌操作技术

第36页/共42页1.培养基灭菌高压蒸汽灭菌灭菌锅0.1～0.13MPa，121℃过滤除菌

0.22or0.45μm滤膜第37页/共42页2.玻璃器皿灭菌湿热灭菌：灭菌后及时置于超净工作台上吹干干热灭菌：160-180℃，40min或120℃，2h3.金属器皿灭菌使用前：干热灭菌使用过程中：将其浸泡在95％酒精中，再用火焰烧去酒精，冷却后使用4.超净工作台用75%乙醇擦洗，紫外灯照射20～30分钟第38页/共42页5.操作人员从事无菌操作的人员，必须进行消毒和灭菌，并严格规范操作程序，如更换工作服、洗手等6.操作环境（实验室）灭菌气