Part基因工程与食品产业

Part基因工程与食品产业第1页/共55页第二章基因工程与食品产业

第一节基因工程概述

第二节基因工程的原理及基本技术

第三节基因工程在食品工业中的应用第2页/共55页

第一节基因工程概述

一、基因工程的概念及发展

1、基因工程（geneengineering)：所谓基因工程，就是利用DNA体外重组或扩增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因或DNA片段，或是经过人工合成的方法获得基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应产生重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。第3页/共55页基因工程(geneengineering)常和以下名称混用:遗传工程(geneticengineering)；基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)；克隆(clone):

作名词时是指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。作动词时是指基因的分离与重组过程。第4页/共55页2、基因工程的发展概况历史回顾：70年代初，DNA已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。今天，人们在超市货价上可以买到保质期很长的转基因土豆，“多利”克隆绵羊走进实验室，基因工程正在使整个人类生活方式发生重大变革。2000.6.26宣告人类基因组“工作框架图”绘制完毕。目前还有许多有价值的微生物，动物，植物的测序工作正在进行中。第5页/共55页人类基因组计划

这一价值30亿美元的计划旨在对人类基因组进行精确测序，发现所有人类基因并确定其在染色体上的位置，明确所有基因的结构和功能，破译人类全部遗传信息，使人类能够在分子水平上全面认识自我。

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第7页/共55页2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。

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二、工具酶和基因载体1、基因工程的工具酶限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶碱性磷酸酯酶S1核酸酶逆转录酶

第9页/共55页限制性内切酶（RE表示）分类：I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。第10页/共55页限制性内切酶的定义、命名定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三种限制酶。第11页/共55页II型限制酶的特点表2.1识别顺序和酶切位点；（位点特异性酶）识别４-8个相连的核苷酸；富含ＧＣ；对称性；（回文结构）切点大多数在识别顺序之内，也有例外；限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ。末端种类：３’-端突起，个数为２或４个核苷酸；５’-端突起，个数为２或４个核苷酸；平齐末端。第12页/共55页限制酶切末端特点5’-突起末端：EcoRI5’—GAATTC—3’5’—GOH

PAATTC—3’3’—CTTAAG—5’3’—CTTAAP

HOG—5’3’-突起末端：PstI5’—CTGCAG—3’5’—CTGCAG—3’

3’—GACGTC—5’3’—GACGTC—5’平端：SmaI5’—CCCGGG—3’5’—CCCGGG---3’3’—GGGCCC—5’3’—GGGCCC—5’第13页/共55页限制酶的用途DNA重组；限制酶（物理）图谱绘制；突变分析（RFLP分析）；限制酶的部分酶切与完全酶切。第14页/共55页DNA连接酶T4DNA连接酶特点：只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基

用途：用于不同DNA分子的连接，形成重组DNA分子

1)相同或相容粘性末端的连接

2)平整末端的相连

第15页/共55页DNA聚合酶

E.coli

的DNA聚合酶系统催化5’→3’方向合成DNA

PolI参与DNA修复具3’→5’和5’→3’外切酶活性

polII

同上具3’→5’外切酶活性

polIII

参与DNA复制具3’→5’和5’→3’外切酶活性第16页/共55页E.colipolI的特点：

1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响

3）外切酶活性

E.colipolI用途：

1）除去3’-端突起的单链DNA

2）补齐5’-突起端

3）合成第二条cDNA链

4）切口移位制备探针

其中用途2)和3)常用大片段第17页/共55页2、基因工程载体载体要求：①在宿主细胞中能独立自主地复制；②易从宿主细胞中分离纯化；③其分子中有一段不影响自身扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以进行复制和扩增。第18页/共55页基因工程载体:质粒载体plasmid:pBR322,pUC18/19；噬菌体载体phage:λ,M13,SV40；柯斯质粒载体cosmid:人工组建，兼具λ、质粒优点。第19页/共55页大肠杆菌质粒分子结构第20页/共55页

大肠杆菌载体pBR322结构图

第21页/共55页三、基因工程理论基础

1、不同基因具有相同的物质基础；基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。第22页/共55页2.基因是可切割的；

限制性内切酶（RestrictionEnzyme），如EcoRI，HindIII等。第23页/共55页3.基因是可以转移的；4.多肽和基因之间存在对应关系；证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据第24页/共55页5.遗传密码是通用的；第25页/共55页6.基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。

所谓“中心法则”，是指遗传信息在细胞内的生物大分子之间转移或传递的基本法则。

第26页/共55页第二章基因工程与食品产业

第一节基因工程概述

第二节基因工程的原理及基本技术

第三节基因工程在食品工业中的应用第27页/共55页第二节基因工程原理及基本技术

一、基因工程的基本原理(1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。

(2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。第28页/共55页

(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉及到基因表达调控的分子生物学原理。

(4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源表达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学的基本理论体。第29页/共55页

二、基因工程基本技术

基因工程主要内容基因工程的实现主要分为四个步骤：第一步：目的基因的分离或制备：人工分离生物基因组群中目的基因及内切酶定位切割或人工酶促合成；第二步：重组DNA：选择载体及目的基因与载体基因重组；

第三步：导入与表达：重组DNA导入受体细胞，目的基因表达出目的效应和性状；第四步：筛选、鉴定：筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。

第30页/共55页（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）；第31页/共55页（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）；（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）；

（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）；

（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）。

第32页/共55页可见，基因工程的上游操作过程可简化：切接转增检第33页/共55页基因工程基本技术1、目的基因的获得与序列分析

1.1目的基因的获得鸟枪法物理化学法化学合成法酶促逆转录合成法PCR扩增法

1.2DNA序列测定化学降解法酶促法自动化测序

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第35页/共55页2、目的基因与载体的连接（重组与克隆）亚克隆黏性末端连接平段连接同聚物加尾连接

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DNA重组技术的基本过程载体系统大肠杆菌质粒外源DNA系统内切核酸酶

内切核酸酶“退火”

DNA连接酶

重组质粒转化受体系统感受态细菌

复制

染色体

“工程菌”

重组质粒第37页/共55页DNA重组技术的基本过程第38页/共55页3、重组DNA向受体的转化转化反应磷酸钙沉淀法体外包装转染法共转化电转化法基因枪法微注射技术法脂质体导入法

第39页/共55页4、重组体筛选与外源基因的鉴定重组体的筛选重组体的鉴定第40页/共55页5、基因食品

转基因食品是利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，使其性状、营养品质、消费品质向人类所需要的目标转变。转基因食品大致可以分为两大类，一是改造现有的基因，使一些性状不表现出来；另外一类是导入其他的基因，从而产生新的性状。6、转基因动物

转基因动物（transgenicanimal）是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。技术体系的组成：（1）克隆目的基因；（2）设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等）；（3）按育种程序进行工程动物的选育和建系第41页/共55页动物体细胞克隆技术为生长蛋白类药物、器官移植、挽救珍惜濒危动物及培育优良品种奠定基础；1997年，Wilmut等用山羊胚胎的核转入去核未受精的卵母细胞，克隆了“Dolly羊”；转基因动物成功引导了一种新型的制药工业，利用转基因山羊，绵羊和乳牛的乳汁生产治疗人类疾病的蛋白类药物；另外克隆经过修饰的猪，为人体器官移植提供外源器官。我国上海转基因研究中心和陕西的中国杨凌克隆动物基地也成功克隆了山羊。转基因动物第42页/共55页第一例转基因动物－转基因鼠第43页/共55页体细胞克隆产生的多利羊第44页/共55页大棚种植的转基因(抗青枯病)马铃薯第45页/共55页基因工程生产的超级小鼠(与正常小鼠)比较第46页/共55页第二章基因工程与食品产业

第一节基因工程概述

第二节基因工程的原理及基本技术

第三节基因工程在食品工业中的应用第47页/共55页第三节基因工程在食品产业中的应用

利用基因工程改造食品微生物利用基因改善食品原料的品质利用基因工程改进食品生产工艺利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品第48页/共55页

利用基因工程改造食品微生物1、改良微生物菌种——基因工程菌

例：面包酵母菌——促进发酵啤酒酵母菌2、