SC-T 3057-2022 水产品及其制品中磷脂含量的测定 液相色谱法

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３０５７—２０２２水产品及其制品中磷脂含量的测定液相色谱法范围本文件描述了用液相色谱法测定水产品及其制品中磷脂含量的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定步骤、结果计算、方法灵敏度和精密度.本文件适用于鱼、贝、虾等水产品及其制品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱５种磷脂含量的测定.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.分析实验室用水规格和试验方法GB/T１５６８７动植物油脂试样的制备GB/T３０８９１—２０１４水产品抽样规范术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.原理试样中磷脂经氯仿Ｇ甲醇溶液提取,固相萃取柱净化,液相色谱Ｇ蒸发光散射检测器检测,外标法定量.试剂和材料警示Ｇ应当严格遵循有毒物质的使用规程.采取有效措施保证组织和个人安全.除另有说明,所有试剂均为色谱纯,试验用水应符合

一级水的规定.５１试剂５１１正己烷(C

H１４).５１２异丙醇(C

HO).５１３氯仿(CHCl).５１４甲醇(CHOH).５１５乙酸(CHCOOH).５１６乙醚(C

H１０O).５１７三乙胺(C

H１５N).５１８盐酸(HCl):优级纯.５１９氯化钠(NaCl):优级纯. １２９２５１１０无水硫酸钠(NaSO):优级纯,２０℃烘干４h,干燥器内冷却至室温, １２９２５１１１正己烷Ｇ异丙醇溶液(＋３):量取４０mL正己烷和６０mL异丙醇,混匀.５１１２氯仿Ｇ甲醇溶液(＋１):量取９mL氯仿和１mL甲醇,混匀.５１１３氯仿Ｇ甲醇溶液(＋１):量取２００mL氯仿和１００mL甲醇,混匀.５１１４０９％氯化钠溶液:称取９g氯化钠,加１０００mL水溶解.

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３０５７—２０２２２１５１１５氯仿Ｇ异丙醇溶液(＋１):量取２００mL氯仿和１００mL异丙醇,混匀.２１５１１６乙酸Ｇ乙醚溶液(＋７２):量取４mL乙酸和２８８mL乙醚,混匀.５１１７盐酸溶液:量取５４mL盐酸,加水定容至１００mL,混匀.２５１１８氯仿Ｇ甲醇Ｇ盐酸溶液(取２００mL氯仿和１００mL甲醇,加入１mL２％盐酸溶液,２混匀.５１１９００４％三乙胺正己烷溶液:准确量取０４mL三乙胺,加正己烷定容至１０００mL,混匀.５１２０１３％乙酸溶液:准确量取１３０mL乙酸,加水定容至１０００mL,混匀.５２标准品５宜选择动物性来源标准品,

种磷脂标准品详细信息见附录

A.５５３标准溶液配制５３１单一标准储备液５ ５５分别准确称取各磷脂标准品适量(精确至０１mg),其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱５ ５５脂酰胆碱用正己烷Ｇ异丙醇溶液(１１１)溶解,磷脂酰肌醇先用０５mL氯仿Ｇ甲醇溶液(１１２)溶解后再加入正己烷Ｇ异丙醇溶液(１１１)稀释并定容,配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺１０００mg/L、磷脂酰肌醇１０００mg/L、磷脂酰胆碱鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱的单一标准储备液,于－１８℃下避光密封保存,有效期为１个月.５３２混合标准中间液５分别准确移取１８mL各磷脂单一标准储备液于同一１０mL棕色容量瓶中,用正己烷－异丙醇溶液５(１１１)稀释并定容,配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺１８０mg/L、磷脂酰肌醇１８０mg/L、磷脂酰胆碱５４０mg/L、鞘磷脂１８０mg/L和溶血磷脂酰胆碱３６０mg/L的混合标准中间液,现用现配.５３３系列混合标准工作溶液５１ ３ ４ ９ １３ ９ １ ２５ ２ ６９ １ ３分别准确移取适量混合标准中间液于１０mL棕色容量瓶中,用５１ ３ ４ ９ １３ ９ １ ２５ ２ ６９ １ ３制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和鞘磷脂:０mg/L、０mg/L、５mg/L、０mg/L、８０mg/L,磷脂酰胆碱:０mg/L、０mg/L、３５mg/L、７０mg/L、４０mg/L;溶血磷脂酰胆碱:０mg/L、０mg/L、０mg/L、８０mg/L、６０mg/L的系列混合标准工作溶液,现用现配.５４材料１氨基固相萃取柱:０００mL,或性能相当者.１仪器和设备６１液相色谱仪:配蒸发光散射检测器.０６２天平:感量为０１mg,００１g和０６３涡旋振荡器.６４离心机:转速≥４０００r/min.６５氮吹仪.６６超声波清洗仪.６７固相萃取装置.试样制备与保存７１试样制备湿基试样制备按照

GB/T３０８９１—２０１４中附录B的规定执行;干制品试样至少２００g,粉碎后全部过０４２mm

孔径分析筛,充分混匀后装入洁净容器中密封备用;油脂试样参照

GB/T１５６８７的规定执行,分取装入洁净容器中密封备用.７２试样保存２,min,％ABC００４０５７８０４０５０１０１５０４０５０１０１５１４０５７２００４０５７SC/T

３０５７—２０２２－１８℃以下避光保存.测定步骤８１提取和净化８１１固体试样８１１１提取５ ４５５ ５３ ５湿基试样称取１g~２g(精确至干制品试样称取０１g~０２g(５ ４５５ ５３ ５离心管中,加入１５mL氯仿Ｇ甲醇溶液(１１３),涡旋混合后超声提取３０min,离心５min,收集上清液,残渣再加入１５mL氯仿Ｇ甲醇溶液(１１３)重复上述操作两次,合并上清液至分液漏斗中,加入１０mL氯化钠溶液(１１４),振荡摇匀后静置分层,收集下层提取液,加入适量无水硫酸钠(１１０)脱水过滤,０℃氮吹至近干,加入２mL氯仿(１３)溶解,待净化.８１１２净化５５ ５５ ５氨基固相萃取柱先用５mL氯仿活化,将待净化液移入氨基固相萃取柱(４),依次用１０mL５５ ５５ ５丙醇溶液(１１５)和１０mL乙酸－乙醚溶液(１１６)淋洗小柱,再依次用１０mL甲醇和１０mL氯仿Ｇ甲醇Ｇ盐酸溶液(１１８)洗脱,收集全部洗脱液,于３０℃下氮吹至近干,加入正己烷－异丙醇溶液(１１１)溶解并定容至１０mL,过０４５μm

尼龙滤膜后待测.８１２油脂试样５称取０２g~０５g油脂试样(精确至加入氯仿(１３)溶解并定容至１０mL,准确移取１５mL按照８１１２进行净化操作.８２测定８２１色谱参考条件１３a)色谱柱:硅胶整体柱

(００mm×４６mm),或性能相当者;１３b)柱温:０℃;２c)进样量:０μL;２１５d)流速:５mL/min;１５e)载气压力:０PSI;６f)漂移管温度:５℃,喷雾器:加热模式７５％;６５５g)流动相:A

相００４％三乙胺正己烷溶液(１１９),B

相异丙醇(１４),C

相１３％乙酸溶５５５(１２０);梯度洗脱程序见表１.５表１流动相梯度洗脱程序８２２标准曲线绘制５１将系列混合标准工作液表１流动相梯度洗脱程序８２２标准曲线绘制５１为横坐标、以相应色谱峰峰面积的对数值为纵坐标,绘制标准曲线.５种磷脂混合标准工作溶液的液相色谱图见附录B.标准曲线方程依蒸发光散射检测原理,按公式()计算.ya １lg

＝blgx＋lg

ya １式中:y

———峰面积;３磷脂类化合物,mg/g,mg/g磷脂酰乙醇胺０１００２０磷脂酰肌醇０１００２０磷脂酰胆碱０３００６０鞘磷脂０１００２０溶血磷脂酰胆碱０２００４０磷脂类化合物,mg/g,mg/g磷脂酰乙醇胺２００４００磷脂酰肌醇２００４００磷脂酰胆碱６００１２００鞘磷脂２００４００溶血磷脂酰胆碱４００８００Xi＝c ×Xi＝c ×V

＋F

()bx ———磷脂标准溶液质量浓度,单位为毫克每升(mg/L);ba、

———与蒸发温度、流动相性质等条件有关的常数.８２３试样溶液测定取试样溶液注入液相色谱仪中,按８２１的色谱条件进行测定,记录色谱峰的保留时间和峰面积,外标法定量.试样溶液中各磷脂色谱峰保留时间与相应磷脂标准色谱峰保留时间的相对偏差不应大于５０％.试样溶液中各磷脂的响应值应在标准曲线范围内,超出范围的试样溶液可适当稀释后再进行测定.８３空白试验除不称取试样外,采用完全相同的测定步骤进行测定.结果计算２试样中各磷脂的含量按公式()计算.２m

×１０００式中:Xi

———试样中各磷脂的含量,单位为毫克每克(mg/g);Ci ———从标准曲线得到的试样溶液中各磷脂的质量浓度,单位为毫克每升(mg/L);V ———试样溶液的最终定容体积,单位为毫升(mL);F ———稀释倍数;gm ———试样的质量,单位为克();g１０００———换算系数.计算结果以重复性条件下２次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留至小数点后２位.１０方法灵敏度和精密度１０１方法检出限和定量限固体试样的方法检出限和定量限见表２,油脂试样的方法检出限和定量限见表３.表２固体试样方法检出限和定量限表３表２固体试样方法检出限和定量限表３油脂试样方法检出限和定量限１０２精密度４序号中文名称英文名称英文缩写CAS,％生物来源磷脂酰乙醇胺PhosphatidylethanolaminePE３９３８２Ｇ０８Ｇ６≥９７鸡蛋黄磷脂酰肌醇PhosphatidylinositolPI３８３９０７Ｇ３３Ｇ３≥９９牛肝脏磷脂酰胆碱PhosphatidylcholinesPC８００２Ｇ４３Ｇ５≥９９鸡蛋黄鞘磷脂linSM８５１８７Ｇ１０Ｇ６≥９８鸡蛋黄溶血磷脂酰胆碱LysophosphatidylcholineLPC９００８Ｇ３０Ｇ４≥９９鸡蛋黄S