基因与研究方法

基因与研究方法第1页/共48页基因及其研究方法利用克隆、PCR、分子杂交方法研究多元化的基因第2页/共48页基因类别结构基因 包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。调控基因 包括调节基因、启动基因和操纵基因。Operon:rDNA,tDNA……第3页/共48页思考操纵子（operon）？操纵基因（operator）？调节基因（regulatorygene）？第4页/共48页操纵子J.Monod与F.Jacob第5页/共48页断裂基因（SpliteGene）70年代由R.J.Roberts和P.A.Sharp首先报道。10S

珠蛋白前体RNA以及其15S

珠蛋白mRNA与小鼠珠蛋白基因杂交形成R环的电镜图第6页/共48页Intron，Extron卵清蛋白基因及其与mRNA或cDNA的杂交图1978年，Gilbert提出内含子、外显子概念。第7页/共48页mRNA剪切第8页/共48页插入序列的生物学功能1在mRNA加工中改变拼接方式或途径可以增加基因片断的利用，使DNA信息储藏量增加。2内含子的存在可能有利于进化过程。3控制RNA拼接系统可以调控基因的表达。4内含子的相对性。第9页/共48页肌球蛋白轻链LC1与LC3基因TATATATAAATAAA

1

2

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转录

加工

1456789

polyALC1mRNA

LC3mRNA

2356789

第10页/共48页酵母细胞色素b基因的内含子2参与编码成熟酶，成熟酶又反过来参与内含子2的剪接，产生成熟的mRNA内含子编码内切酶第11页/共48页插入序列与间隔区插入序列 内含子间隔区 转录间隔区 非转录间隔区第12页/共48页剪切的思考

－Crick1978年提出的几个问题剪切作用若是通过酶来作用的，酶是如何识别RNA上特定位点的？剪切酶有没有特异性？不同RNA是否需要不同的酶？切除的RNA是以线状还是环状存在的？命运如何？内含子有无调控作用？第13页/共48页前体mRNA的拼接核酶的发现及意义

1981年，T.Cech和S.Altman剪接识别顺序

ChambonsruleGT------AG内含子结构SnRNA在RNA剪接中的作用。(smallnuclearRNA) U-SnRNA90-400nt第14页/共48页编码核苷酸比实际多，Why？1978年，Sanger分析了ΦΧ174中的核苷酸，5386个。9个基因，编码2000个氨基酸。???Barrell（Sanger实验室）第15页/共48页重叠基因噬菌体X174的重叠基因各基因的功能：A，DNA单链合成和双链的复制；B、C、D，单链的合成和（或）包装；F、G、H，噬菌体衣壳的结构蛋白；J，参与病毒颗粒构成的一种小的碱性蛋白；K，产物未知；E，细胞裂解第16页/共48页基因重叠的方式包含首尾重叠三个基因的三重重叠反向重叠操纵子重叠第17页/共48页跳跃基因1950年，B.McClintock发现玉米中的Ac-Ds系统。第18页/共48页转座子第19页/共48页转座子转移第20页/共48页原核生物的转座模型第21页/共48页转座带来的基因重排第22页/共48页转座子的遗传学效应引起插入突变。插入位置上出现新基因。原来位置上保持或切离着原有的转座子。造成插入位置上受体DNA形成正向重复序列。调节基因活动的开关。增加同源序列的整合。第23页/共48页C值矛盾不同门类生物的C值分布第24页/共48页基因特性结构基因，调控基因操纵子，操纵基因断裂基因，Intron，Extron重叠基因跳跃基因，转座子C值矛盾第25页/共48页DNA分析方法与技术组成Hemoglobin的四种多肽链在发育中是变化的。第26页/共48页我们要做什么？将庞大的DNA链切成小的可操作片断。对要保存和进一步研究的DNA片断进行扩增。证明、获取DNA片断中所需基因。对感兴趣的片断进行表征。第27页/共48页限制性内切酶常用限制性内切酶种类及特性W.Arber和H.O.Smith第28页/共48页限制性内切酶的剪切方式第29页/共48页切点出现的频率及片断大小第30页/共48页部分消化和完全消化第31页/共48页DNA限制酶分析第32页/共48页其它工具酶连接酶T4DNALigase1967修补工具酶DNA聚合酶I大片断Klenow1971末端加工酶S1核酸酶，碱性磷酸单脂酶末端转移酶人工加polyA或polyT尾反转录酶第33页/共48页DNA扩增PCR反应第34页/共48页DNA片断的克隆载体:AspecializedDNAsequencethatcanenteralivingcell,signalitspresencetoaninvestigatorbyconferringadetectablepropertyonthehostcell,andprovideameansofreplicationforintselfandforeignDNAinsertedintoit.载体的条件：a复制起点b适宜的限制酶切点c选择标记第35页/共48页载体的类型克隆载体穿梭载体表达载体质粒噬菌体人工染色体第36页/共48页质粒载体第37页/共48页噬菌体载体第38页/共48页粘粒载体第39页/共48页酵母人工染色体第40页/共48页基因文库的建立AcollectionofDNAclonesthatcontainsmultiplecopiesofnearlyeveryfragmentinthewholegenomeinsertedintoasuitablevectorandplacedintostorage.第41页/共48页重组DNA的鉴定遗传学方法第42页/共48页免疫学方法如鸡的原肌球蛋白基因的检测肌球蛋白的免疫