基因工程克隆

基因工程克隆第1页/共35页主要参考资料*《基因克隆和DNA分析(第5版)》,布朗（英），魏群翻译，高等教育出版社，2008*《基因工程原理》，吴乃虎编著，北京高等教育出版社，1989，Q75/11*《GenecloningandDNAanalysis6thed》,byT.A.Brown,WileyBlackwell,2008

*《Geneticengineering》，byDesmondS.T.Nicholl,Cambridge,2008第2页/共35页主要参考资料•

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Nature第3页/共35页基因克隆和DNA分析第一章基因克隆的历史背景第二章基因克隆的载体第三章基因克隆的重要酶第四章克隆重组体的构建、转化第五章重组体克隆筛选与鉴定第六章目的基因的分离第七章PCR技术第八章基因和基因组的测序第九章基因的表达和功能研究第十章基因组的研究第十一章蛋白质的表达第十二章基因工程医学应用第十三章基因工程农业应用第十四章基因工程法医学应用

基本原理研究生物技术第4页/共35页第一章基因工程的历史背景第一节基因工程的诞生第二节基因工程的定义第三节什么是基因克隆第四节基因克隆的步骤第五节PCR技术第六节如何学习这门课第5页/共35页1865年孟德尔

豌豆杂交试验1944年Avery

肺炎双球菌转化遗传物质DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鲍耶

DNA分子体外拼接基因工程诞生1953年Watson-crick

DNA双螺旋结构第一节基因工程的诞生第6页/共35页第一节基因工程的诞生1865年，孟德尔，“遗传因子”…………1903,W.Sutton和T.Boveri

遗传因子定位于

染色体，杂交试验-染色体的行为吻和1909年，W.Johansen

，“基因”1910，Morgan果蝇染色体定位2000个基因第7页/共35页第一节基因工程的诞生

20世纪40年代，Avery等发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。第8页/共35页40年代，证实DNA是遗传物质

早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和蛋白质构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？

1928年，英国微生物学家F.Griffith（格里菲思）著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65℃加热：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65℃加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。

第9页/共35页肺炎病菌实验

第10页/共35页20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA

双螺旋结构模型第11页/共35页Watson-crick重温当年第12页/共35页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）

既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。

第13页/共35页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）

第14页/共35页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）

第15页/共35页第一节基因工程的诞生

基因克隆的成功（Cohen+Berg)1973

1972年，Berg，第一个实现DNA重组的人

1973年，Cohen等，第一个实现重组体转化

第16页/共35页第一节基因工程的诞生

基因克隆的成功（Cohen+Berg)1973

1973年，Cohen和Berg将E.coil的Ter质粒psclol和Ner质粒srR6-3体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coil，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了Ter+Ner,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，1973被定为基因工程诞生的元年。

第17页/共35页Cohen等的重组实验示意图TcrNerEcoRIEcoRI连接酶TcrNer双抗重组菌落基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化第18页/共35页第二节基因工程的定义

（一）基因（gene）

从化学上来说，指的是一段DNA或RNA序列，该序列可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype）。

从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。第19页/共35页第二节基因工程的定义

（二）基因工程（geneticengineering）基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

第20页/共35页第二节基因工程的定义

(三)与基因工程相关的概念：

重组DNA技术（DNArecombinationtechnique）是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

第21页/共35页第二节基因工程的定义

(三)与基因工程相关的概念：

生物工程（Biotechnology）也译成生物技术，是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术，包括：基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程

。

第22页/共35页第二节基因工程的定义

(三)与基因工程相关的概念：

基因克隆（genecloning）：是基因工程的核心技术。

第23页/共35页第三节什么是基因克隆克隆这个术语的几种含义：

（1）作为名词

①带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体。②最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNA片断的载体分子。（colony………clone)（2）作为动词，是“去克隆”，即利用体外DNA重组技术将一个特定的基因或DNA顺序插入一个载体分子。第24页/共35页第三节什么是基因克隆克隆原意是指单细胞纯系无性繁殖。（colony………clone)2.基因克隆（genecloning）是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。第25页/共35页第四节基因克隆的步骤1．

载体的选择和制备——分；2．

制备目的基因片段——切；3．

DNA片段的重组连接——接；4．

重组DNA导入受体细胞——转；5．

重组子的筛选——筛；6．

重组子的扩增——增；7．

重组子的表达——克隆成功完成第26页/共35页4基因工程的操作过程切接转增检第27页/共35页SelectionofpositivecloneIntroductionintoahostcellJoiningtoavector

GenerationofDNAfragmentGenecloning

第28页/共35页思考题：名词解释：基因克隆，生物工程，重组DNA技术。简述基因克隆的步骤。第29页/共35页第二章基因克隆的载体

引言：载体的概念（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第30页/共35页把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。

引言：载体的概念第31页/共35页复制起始位点：克隆载体中的一段DNA序列，能够使质粒在宿主细胞内独立复制。多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。第32页/共35页选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。第3