基因工程原理

基因工程原理第1页/共55页第一节基因工程的原理普通玫瑰蓝色妖姬思考：蓝色妖姬如何培育的？第2页/共55页“蓝色妖姬”最早来自荷兰是一种加工花卉。它是用一种对人体无害的染色剂和助染剂调合成着色剂，等白玫瑰（或白月季）快到花期时，开始用染料浇灌花卉，让花像吸水一样，将色剂吸入进行染色。据花卉专家介绍，目前世界上极少有自然生长的蓝色玫瑰花，现在市场上出售的“蓝色妖姬”都是人工染色后的产物。比较正规的“蓝色妖姬”是在花卉的成长期开始染色，颜色能均匀地附着在花瓣上，看上去比较自然；部分商贩直接将普通的白玫瑰花采摘后染成蓝色，颜色不自然，也容易掉色。2008年11月1日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。这种蓝玫瑰是转基因玫瑰，被植入三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝色。第3页/共55页基因工程培育蓝色玫瑰的简要过程：普通玫瑰(无蓝色)蓝色基因与运载体DNA拼接导入普通玫瑰细胞(含蓝色基因)蓝色玫瑰(有蓝色)上述培育蓝色玫瑰的关键步骤是什么？三色紫罗兰提取第4页/共55页基因工程培育蓝色玫瑰的关键步骤：关键步骤一：从三色紫罗兰中提取蓝色基因关键步骤二：蓝色基因与运载体DNA连接关键步骤三：蓝色基因导入受体(普通玫瑰)细胞第5页/共55页解决培育蓝色玫瑰的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体第6页/共55页1.基因工程又叫什么？2.基因工程的工具有哪些？3.“分子手术刀”是什么？作用是什么？断开的化学键是什么？4.“分子缝合针”是什么？作用是什么？缝合的化学键是什么？链接的是什么？5.“分子运输车”是什么？作用是什么？需要什么条件？常用的载体有哪些？我展示我精彩第7页/共55页展示问题展示小组点评1.基因工程又叫什么？10组B/C5组A2.基因工程的工具有哪些？9组B/C4组A3.“分子手术刀”是什么？作用是什么？断开的化学键是什么？8组B/C3组A4.“分子缝合针”是什么？作用是什么？缝合的化学键是什么？链接的是什么？7组B/C2组A5.“分子运输车”是什么？作用是什么？需要什么条件？常用的载体有哪些？6组B/C1组A第8页/共55页基因工程按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外_________，并与特殊的运载工具进行____________，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。剪切重新组合第9页/共55页DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”──限制酶

“分子缝合针”──DNA连接酶

“分子运输车”──基因进入受体细胞的载体

一、基因工程所需的工具第10页/共55页识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端(一)、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶黏性末端平末端第11页/共55页限制性内切酶作用过程点击播放第12页/共55页DNA连接酶1.连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。

问题用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？2.连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。第13页/共55页DNA连接酶的作用过程点击播放第14页/共55页

大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶什么叫黏性末端？第15页/共55页限制酶什么叫黏性末端？第16页/共55页什么叫黏性末端？

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第17页/共55页什么叫平末端？

当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。第18页/共55页(二)、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶

磷酸二酯键

DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。第19页/共55页DNA连接酶的作用过程返回第20页/共55页APCPGPTPAPCPGPTP限制酶切割的是哪个部位的键?第21页/共55页第22页/共55页T磷酸二酯键1234512345A第23页/共55页

DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？第24页/共55页（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。第25页/共55页(三)、基因进入受体细胞的运载体——“分子运输车”（1）运载体的作用作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）（2）作为运载体必须具备的条件能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。必需是安全的，不会对受体细胞有害。大小应适合，便于提取和操作第26页/共55页（3）常用的运载体

基因进入受体细胞的运载体——“分子运输车”细菌细胞质的质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。第27页/共55页基因进入受体细胞的运载体——“分子运输车”

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒是基因工程最常用的运载体。第28页/共55页“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体：第29页/共55页二、基因工程

概念：按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。意义：能够打破生物种属的界限，在分子水平上定向改造生物的遗传特性。第30页/共55页二、基因工程的操作程序目的基因的获得重组载体的构建重组载体的转化和筛选目的基因的表达和鉴定第31页/共55页获取目的基因的方法用限制酶切断成许多片段⑴直接分离法

——鸟枪法

用限制酶将完整的DNA随机切成许多片段，然后用某种检测方法挑选出所需要的基因。如用“核酸探针法”，核酸探针是用放射性同位素标记的DNA单链，具有非常特异的脱氧核苷酸序列，能与DNA互补链结合。第32页/共55页⑵人工合成法——反转录法和化学合成法反转录法：

mRNA→单链DNA→双链DNA（目的基因）

化学合成法：氨基酸序列→基因序列→合成目的基因返回第33页/共55页

运载工具——载体(质粒)

第34页/共55页用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。提取质粒并用限制酶切割用连接酶将目的基因和质粒连接重组载体的构建第35页/共55页目的基因与质粒的连接返回第36页/共55页重组载体的转化和筛选转化方法：基因枪法、显微注射法和花粉管通道法。受体是动物细胞时最常用的是显微注射法，是植物细胞时常用基因枪法。筛选：利用载体上的标记基因，借助选择培养基进行筛选。将目的基因导入受体细胞有表达产物(导入）无表达产物（未导入）选择培养基（载体标记基因）返回第37页/共55页目的基因的表达和鉴定基因工程成功的标志：目的基因表达，进而产生相应的性状。鉴定：检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状。

例：用转基因棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明目的基因未表达；如虫吃后中毒死亡，则说明目的基因表达。返回第38页/共55页课本知识回顾

基因工程又叫做

或

。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种

提取出来，加以

，然后放到另一种生物的细胞里，

改造生物的遗传性状。基因拼接技术DNA重组技术基因修饰改造定向地第39页/共55页DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”──“分子缝合针”──“分子运输车”──限制酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体第40页/共55页限制性核酸内切酶主要是从的一种酶。识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。形成两种末端原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列磷酸二酯键粘性末端平末端第41页/共55页二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键第42页/共55页基因进入受体细胞的载体通常有三种:在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在基础上进行过的质粒λ噬菌体衍生物动植物病毒天然质粒人工改造第43页/共55页1.如图所示为部分双链DNA片段，下列有关基因工程中工具酶功能的叙述错误的是 (

)A．切断a处的酶为限制性核酸内切酶B．连接a处的酶为DNA连接酶C．切断b处的酶为DNA解旋酶D．连接b处的酶为RNA聚合酶课堂反馈D第44页/共55页2．下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是 A．用同种限制性核酸内切酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功D．用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接A第45页/共55页3．下列一般不作为基因工程中的标记基因的是 (

)A．四环素抗性基因B．绿色荧光蛋白基因C．产物具有颜色反应的基因D．贮藏蛋白的基因D第46页/共55页4．质粒作为“分子运输车”的条件是 (

)①能够自我复制②双链环状DNA分子③有多个限制性核酸内切酶切割位点④有标记基因⑤真核细胞中没有A．①②③④⑤

B．①②③④C．①③④

D．②③⑤B第47页/共55页5．下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是 (

)A．需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶B．必须在细胞内进行C．抗生素抗性基因可作为标记基因D．启动子位于目的基因的首端B第48页/共55页6．下面是获得抗虫棉的技术流程示意图。有关叙述错误的是

(

)A．重组质粒构建过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶B．图中愈伤组织分化产生的再生植株基因型一般都相同C．卡那霉素抗性基因中含有相关限制性核酸内切酶的识别位点D．转基因抗虫棉有性生殖的后代不能稳定保持抗虫性状D第49页/共55页7．哪项不是基因表达载体的组成部分()A．启动子B．终止密码 C．标记基因D．目的基因8、下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A．基因枪法B．显微注射法 C．农杆菌转化法D．花粉管通道法9．基因工程中常用的受体细胞不包括()A．人体细胞B．动物细胞 C．植物细胞D．微生物细胞DBA第50页/共55页10．基因工程的正确操作步骤是()①构建基因表达载体 ②将目的基因导入受体细胞 ③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④取目的基因A．③②④①B．②④①③ C．④①②③D．③④