基础生物化学第dna章

基础生物化学第dna章第1页/共130页本章重点与难点重点：掌握中心法则；半保留复制、半不连续复制、反转录、基因工程的概念；参与DNA复制的有关酶类和蛋白质及DNA的复制过程；DNA损伤修复的方式。难点：对DNA的半保留复制、半不连续复制的理解。第2页/共130页遗传的中心法则1958年Crick提出以DNA为中心的遗传信息的传递规律，即DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代DNA，通过转录传给RNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为～。DNARNA蛋白质复制复制转录翻译反转录1970年Temin和Baltimore发现RNA病毒的RNA可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给cDNA，也可通过RNA复制或RNA转录传给子代RNA，这是对中心法则的补充。1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向DNA传递。？第3页/共130页

复制（DDDP）

转录（DDRP）

翻译

DNAmRNA蛋白质

反转录（RDDP）

RNA

复制（RDRP）

第4页/共130页DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。第5页/共130页复制(replication)是指遗传物质的传代，以亲代（母链）DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA第6页/共130页一、DNA复制的基本规律（一般原理）BasicRulesofDNAReplication

第7页/共130页复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)

第8页/共130页（一）DNA复制是半保留复制(semi-conservativereplication)DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念第9页/共130页AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

第10页/共130页子链继承母链遗传信息的几种可能方式

全保留式半保留式混合式（散布式）第11页/共130页DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的密度飘移实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：

第12页/共130页密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果第13页/共130页按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。第14页/共130页原核生物复制时，DNA从原点

(起始点，origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。（二）DNA复制是固定起点的双向复制复制中的放射自显影图象第15页/共130页第16页/共130页A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC第17页/共130页真核生物每个染色体有多个复制原点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻复制原点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是能够独立完成复制的功能单位。第18页/共130页5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’第19页/共130页（三）DNA复制是半不连续复制3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)第20页/共130页顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为先导链或领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随后链或随从链。复制中的不连续片段（约1000个核苷酸）称为岡崎片段(okazakifragment，1968)。

先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连续复制或复制的半不连续性。

第21页/共130页由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

第22页/共130页（四）需要引物参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)

，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。第23页/共130页

二、DNA复制的酶学（DNA复制相关的酶和蛋白质）TheEnzymologyofDNAReplication第24页/共130页参与DNA复制的物质

底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DDDP或DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子第25页/共130页（一）复制的化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目录第26页/共130页聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板

DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

新链的延长只可沿5→3方向进行（模板方向为3→5

，合成方向为5→3

。）第27页/共130页（二）DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性第28页/共130页5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´

35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突变的DNA片段和RNA引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性第29页/共130页第30页/共130页1、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ第31页/共130页催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数+-+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶第32页/共130页原核生物的DNA聚合酶第33页/共130页功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）第34页/共130页323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

第35页/共130页第36页/共130页DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

第37页/共130页功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ：由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。

(250kD)第38页/共130页2、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol第39页/共130页真核生物的DNA聚合酶第40页/共130页在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，参与染色体DNA复制的是polα（延长随从链）和polδ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

第41页/共130页（三）复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

复制的保真性和碱基选择第42页/共130页1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。第43页/共130页2、复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

第44页/共130页1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

第45页/共130页（四）复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

第46页/共130页1、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白第47页/共130页E.Coli基因图目录第48页/共130页解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

第49页/共130页解螺旋酶（unwindingenzyme），又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。第50页/共130页单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

第51页/共130页引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

第52页/共130页108

局部解链后2、DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

第53页/共130页解链过程中正超螺旋的形成目录第54页/共130页拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类第55页/共130页拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

第56页/共130页目录第57页/共130页（五）DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式第58页/共130页HO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’第59页/共130页DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。第60页/共130页DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能第61页/共130页三、DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第62页/共130页1、复制的起始需要解决两个问题：1）

DNA解开成单链，提供模板。2）合成引物，提供3-OH末端。（一）原核生物的DNA生物合成

第63页/共130页E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5353a.DNA解链第64页/共130页DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3535b.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

第65页/共130页3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第66页/共130页复制的起始

DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。预引发：

1．解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。

DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。第67页/共130页2．引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

第68页/共130页引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

第69页/共130页2、复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

第70页/共130页聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。

第71页/共130页引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

第72页/共130页第73页/共130页5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第74页/共130页领头链的合成第75页/共130页随从链的合成第76页/共130页第77页/共130页阶段一阶段二第78页/共130页阶段三阶段四第79页/共130页复制过程简图第80页/共130页原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV405003、复制的终止第81页/共130页555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接第82页/共130页第83页/共130页去除引物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

第84页/共130页连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

第85页/共130页哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM（二）真核生物的DNA生物合成

•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。第86页/共130页•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。1、复制的起始第87页/共130页3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体2、复制的延长第88页/共130页染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。3、复制的终止第89页/共130页53355335+5333355第90页/共130页第91页/共130页切除引物的两种机制第92页/共130页端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第93页/共130页端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成第94页/共130页端粒酶的催化延长作用爬行模型第95页/共130页DNA聚合酶复制子链进一步加工第96页/共130页四、逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第97页/共130页逆转录酶(reversetranscriptase)

逆转录(reversetranscription)

RNADNA

逆转录酶（一）逆转录病毒和逆转录酶

第98页/共130页反转录（reversetranscription）：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。1970年，Temin和Baltimore分别从致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。放线菌素D（抑制以DNA为模板的反应，复制和转录）能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。Bader用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV），证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中新合成的。第99页/共130页反转录酶由一个α亚基和一个β亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。（1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNA—DNA杂种分子）。（2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。（3）DNA指导的DNA聚合酶活力。模板：RNA或DNA以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。引物：RNA或DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+或Mn2+真核mRNA3’端有polyA，加入oligodT后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA。第100页/共130页逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA

杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA第101页/共130页逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第102页/共130页（二）逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

第103页/共130页

滚环复制(rollingcirclereplication)（三）滚环复制和D环复制

是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。第104页/共130页3-OH5-P55533335'滚环复制5'5335第105页/共130页dNTPDNA-polγ

D环复制(D-loopreplication)

是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。

第106页/共130页五、DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair第107页/共130页遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

第108页/共130页（一）突变的意义1、突变是进化、分化的分子基础2、突变导致基因型改变3、突变导致死亡4、突变是某些疾病的发病基础

第109页/共130页（二）引发突变的因素物理因素紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV第110页/共130页第111页/共130页化学因素第112页/共130页（三）突变的分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

第113页/共130页DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1）转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2)颠换1、错配第114页/共130页镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

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C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

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glu

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·

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·

C肽链CTCGAG基因第115页/共130页2、缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码