基因定位常用的方法课件

第四节基因定位常用的方法Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因定位于1号染色体上,是人类首次在常染色体上进行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用，基因定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促进了基因定位的进程。基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的认识有重要意义。1明确几个基本概念基因：DNA的功能片段。基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的总和。基因定位：是用一定的方法将基因确定到染色体的实际位置。2遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞遗传图区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。3

2）对象：人的细胞鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠

3）杂种细胞的特点：在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。54）原理：细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。6HAT选择系统：

人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶小鼠细胞株：缺乏TK酶两者融合培养于HAT培养基中HAT培养基：

H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料7鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍）

杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

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将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。10鼠人XTK-HPRT+TK+HPRT-鼠人鼠人鼠人TK+HPRT+173173173TK+TK+TK-HAT112.原位杂交和荧光原位杂交

1）原位杂交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于11p15。2）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链或DNA-RNA双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，可检测细胞基因组中的同源部分。133）原位杂交的特点：杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。144）原位杂交的步骤

制备中期染色体

DNA原位变性

变性放射性或非放射性标记探针

杂交（在载玻片上）

洗膜

放射性标记：放射自显影

检测非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合记录杂交信号结合染色体形态进行基因定位15单色FISH17多色FISH183.连锁分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。1921致病基因和标记座的连锁22遗传多态性：是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于1%。常用的遗传标记：

①ABO血型蛋白多态

②血清蛋白泳动学改变

③HLA

④RFLP小卫星DNA：VNTR6-12个核苷酸DNA多态

⑤VNTR微卫星DNA：STR2-6个的VNTR

⑥SNPs232、定位克隆(positionalcloning)是先进行基因定位作图,然后找到来自该定位区的基因并进行克隆,在此之后才能明确该基因的功能.

功能克隆和定位克隆的比较:在传统的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鉴定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鉴定基因.基因已鉴定后,可以进行基因功能的选择性研究.

2526DMD基因克隆的方法

研究者们通过对几个女性患者的细胞遗传学研究发现每个病例受累的常染色体不同但在X染色体上的断裂点总是p21。同时一个无任何遗传缺陷家族史的男孩被发现患有DMD等4种X连锁隐性遗传病，在这个独一无二个体的引发下，经过仔细的遗传学研究，最终发现了Xp21.1的微小缺失。29DMD女性患者的核型30X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果31两个研究小组分别采用两种不同的方法克隆了DMD基因：一组是通过X常染色体易位，克隆了该基因的一部分。另一研究组使用有Xp21.1