抗生素类药物的分析演示文稿

抗生素类药物的分析演示文稿当前1页，总共83页。（优选）抗生素类药物的分析当前2页，总共83页。性质复杂：化学纯度低——三多：同系物多异构体多降解物多活性组份易变异稳定性差当前3页，总共83页。1、抗生素类药物一般检查项目：①鉴别试验:用化学法、物理化学法以及生物学法来确认是哪种抗生素②毒性试验:控制药品中的毒性物质③无菌试验:检查药品中有无杂菌污染④热源试验:控制药品中的致热物质⑤水分测定:控制水分含量⑥溶液澄明度检查:检查不溶性物质⑦

溶液pH试验:测定pH⑧降压试验:检查有降压作用的杂质⑨

效价测定:有效成分测定当前4页，总共83页。

2、效价测定抗生素活性表示方法：效价。效价：每毫升或每毫克含有某种抗生素的有效成分的多少。抗生素的效价测定方法有:生物学法物理化学法目前各国药典仍以生物学测定法为主。青霉素钠：1670单位/毫克庆大霉素：590单位/毫克当前5页，总共83页。(1)

生物学测定法以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准。优点：①原理恰好与临床要求一致，更能够确定抗生素效价。②灵敏度高，需要样品量较小③

既适用较纯精制品,也适用于纯度较差的产品④

已知或新发现抗生素都能应用⑤同一类型的抗生素,不需要分离,可一次测定它们的总效价。缺点:①

操作步骤多，测定时间较长②

误差较大当前6页，总共83页。(2)

物理化学测定法根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。优点:①

操作简单、省时、方法准确②

具有较高的专属性缺点:对于结构相似的抗生素，测定结果往往只能代表总的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效价，只有当用物理化学法测定结果与用生物学法测定效价相一致时，才能用于效价测定。当前7页，总共83页。3、本章内容＊-内酰胺类:青霉素类头孢菌素类＊氨基糖苷类: 链霉素庆大霉素＊四环素类当前8页，总共83页。一、化学结构与性质1、化学结构①

青霉素类结构母核:由-内酰胺环和氢化噻唑环组成的双杂环。6-氨基青霉烷酸（6－APA）母核无UV吸收不稳定***酸性第二节-内酰胺类抗生素的分析当前9页，总共83页。（青霉素G、苄青霉素）当前10页，总共83页。氨苄西林

（氨苄青霉素）当前11页，总共83页。阿莫西林

（羟氨苄青霉素）当前12页，总共83页。②

头孢菌素类结构母核:-内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。不稳定酸性**7-氨基头孢菌烷酸（7－ACA）母核有UV吸收当前13页，总共83页。头孢氨苄当前14页，总共83页。头孢拉定当前15页，总共83页。头孢羟氨苄当前16页，总共83页。2、性质青霉素类和头孢菌素类结构共同特点：具有-内酰胺环。①

酸性＊有羧基，具有酸性＊pKa值在2.5-2.8之间＊与碱成盐如：青霉素G钠、青霉素G钾等当前17页，总共83页。②

旋光性有手性碳原子，具有旋光性3个手性碳原子（C3、C5、C6）2个手性碳原子（C6、C7）当前18页，总共83页。③

紫外吸收＊青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收＊但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。＊侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区也有吸收。像苄青霉素。＊头孢菌素类分子中有共轭体系（O＝C－N－C＝C），在260nm处有最大吸收。当前19页，总共83页。当前20页，总共83页。④-内酰胺环的不稳定性干燥、纯净青霉素类抗生素稳定，其水溶液很不稳定，不稳定的部分是-内酰胺环。-内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下，可使-内酰胺环开环或发生分子重排，而失去抗菌作用。当前21页，总共83页。当前22页，总共83页。二、鉴别试验1、羟肟酸铁反应(β-内酰胺类)当前23页，总共83页。2、茚三酮反应△当前24页，总共83页。3、双缩脲反应（β-内酰胺类）似肽键（开环分解）当前25页，总共83页。4、与变色酸-硫酸反应（活泼“-CH2-”）青霉素阿莫西林氨苄西林当前26页，总共83页。5、与重氮苯磺酸反应（酚羟基）（偶合）举例：头孢哌酮当前27页，总共83页。6、UV法头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+当前28页，总共83页。7、IR法（chp2010版）

该类抗生素共有的特征峰：－内酰胺环羰基（1750～1800cm-1

）；仲酰胺的氨基、羰基（3300cm-1，1525cm-1，1680cm-1）；羧酸离子（1600cm-1、1410cm-1）；取代苯（760～850cm-1）当前29页，总共83页。当前30页，总共83页。8、色谱法（1）TLC法（2）HPLC法（chp2010版）当前31页，总共83页。1、碘量法①原理：青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，其在碱性条件下水解生成的降解产物—青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的碘量可以计算青霉素的含量。

三、含量测定当前32页，总共83页。②方法：以“青霉素钠”为例（1）主试验：当前33页，总共83页。（2）空白试验：空白试验：做法与一般空白不同（加样品,不加碱水解,其他操作同样品）＊目的：消除样品中预先存在的降解产物（青霉噻唑酸）及其他耗碘杂质的影响当前34页，总共83页。2、HPLC法（chp2010）特点：快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）当前35页，总共83页。头孢呋辛酯例当前36页，总共83页。第三节氨基糖苷类抗生素的分析一、化学结构及性质（一）链霉素1、结构当前37页，总共83页。链霉素当前38页，总共83页。2、性质：（1）三个碱性中心：2个强碱性胍基（PKa=11.5）

1个甲胺基（PKa=7.7）可与矿酸或有机酸成盐（硫酸盐）（2）链霉素在酸性或碱性条件下可变为链霉胍和链霉双糖胺当前39页，总共83页。（二）庆大霉素1、结构当前40页，总共83页。2、性质：（1）五个碱性中心可与矿酸或有机酸成盐（2）无UV吸收，（因为无共轭系统）当前41页，总共83页。二、鉴别试验（一）共同反应1、茚三酮反应氨基糖苷结构，具羟基胺类和α-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物。△当前42页，总共83页。2、N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应。当前43页，总共83页。3、Molisch试验该类药物酸水解后，在盐酸（硫酸）作用下脱水成糠醛或羟甲基糠醛，遇α-萘酚或蒽酮显色。当前44页，总共83页。4、SO42-反应H+5、TLC法6、IR法7、UV法8、HPLC法当前45页，总共83页。（二）链霉素的特征反应1、麦芽酚反应：链霉素在碱性溶液中，链酶糖经分子重排，消除N—甲基葡萄糖胺及链酶胍，生成麦牙酚，麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。当前46页，总共83页。当前47页，总共83页。2、坂口反应（链霉胍特有反应）当前48页，总共83页。1.微生物检定法：本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。三、含量测定（链霉素、庆大霉素）2.衍生化HPLC法：选用OPA为荧光衍生化试剂。（2005版）3.直接HPLC法：蒸发光散射检测器（2010版）当前49页，总共83页。第四节四环素类抗生素的分析当前50页，总共83页。四环素（TC）

tetracycline当前51页，总共83页。金霉素(CTC)

chlortetracycline当前52页，总共83页。一、化学结构当前53页，总共83页。A环B环C环D环二甲氨基—N(CH3)2酚羟基酰胺基—CONH2酮基与烯醇共共轭酮基与烯醇基共轭双键系统双键系统当前54页，总共83页。二、性质1、呈两性：弱酸性——酚羟基、烯醇型羟基弱碱性——二甲胺基所以遇酸或碱均可成盐当前55页，总共83页。2、含结晶水四环素：6个结晶水占19.6%土霉素：2个结晶水占7.5%

加热时可失去结晶水,当含水量低于19.6%的四环素和低于7.5%的土霉素,置于空气中要吸收水分。当前56页，总共83页。3、溶解度：游离体在水中溶解度很小，溶解度与pH有关。难溶于水,pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.当前57页，总共83页。4．稳定性：对各种氧化剂都不稳定，且碱性水溶液特别易氧化，颜色很快变深形成色素，干燥品较稳定，但贮存时遇光可使颜色变深（因空气氧化）。当前58页，总共83页。三．化学反应：1.差向异构化反应：（差向四环素）弱酸性（pH2.0-6.0）溶液中，A环上手性C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素。差向化速度的影响因素：pH<2或pH>9时，差向化速度很小。高价的无机酸或有机酸根存在或阴离子浓度增加，差向化速度增大。当前59页，总共83页。当前60页，总共83页。2.酸性下降解反应:（脱水四环素类）在酸性（pH<2）时，C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水，在C6-C5a间形成双键。经重排使C环芳构化，生成脱水四环素类。四环素、土霉素和金霉素可发生脱水；强力霉素不发生（C6无OH）。当前61页，总共83页。当前62页，总共83页。3.碱性下降解反应：（异四环素类）在碱性下，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环素；若强碱性下加热，可定量地转化为异四环素，后者具有强烈荧光，可荧光法测定。强力霉素不发生反应，因C6无OH。当前63页，总共83页。4.与金属离子络合：能与许多金属离子（锆Zr4+,铀U6+,锌Zn2+,铜Cu2+,铝Al3+,镁Mg2+，铈Ce4+,钴Co2+）形成有色络合物。当前64页，总共83页。四．鉴别试验1.

与浓硫酸反应：当前65页，总共83页。2.FeCl3反应：当前66页，总共83页。3．荧光反应：四环素类在紫外灯下产生荧光，其降解产物也具有荧光，可供鉴别。当前67页，总共83页。4、HPLC法5、TLC法6、IR法7、UV法当前68页，总共83页。五．杂质检查：(一)有关物质降解产物及异构杂质,会造成药品质量下降。可引起恶心、呕吐、糖尿、蛋白尿及酸中毒，称为Fanconi症侯群。当前69页，总共83页。引起毒性反应的主要物质为差向异构体、脱水物、差向脱水物质，统称为有关物质。ChP2010采用HPLC法检查。脱水物和差向脱水物含量越高，其吸收度越大，因此，ChP还规定杂质的吸收度的限量。

4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）

当前70页，总共83页。（二）杂质吸收度盐酸四环素λmax=268nmλmax=355nm当前71页，总共83页。当前72页，总共83页。系统适用性试验1.防护柱2.预试溶液

4-差向脱水四环素四环素3.RSD≤2.0%六、含量测定-----HPLC法（外标法）当前73页，总共83页。第五节抗生素药物中高分子杂质的检查1、为何要进行抗生素中高分子杂质的检查？

抗生素是临床用量最大和较易发生不良反应的药物。其中最常见的一类不良反应就是过敏反应。多年来的研究已证明，在β－内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应中，药物分子本身只是半抗原，药物中存在的高分子杂质才是引发速发型过敏反应的真正过敏原，因此严格控制抗生素中高分子杂质的含量有着重要的意义。当前74页，总共83页。2、高分子聚合物的分类

抗生素中的高分子杂质系指药品中分子量大于药物本身的杂质总称，其分子量一般在1000～5000Da，个别可达10000Da左右。β－内酰胺类抗生素中的高分子杂质按其来源通常被分为两类：外源性杂质和内源性杂质。

外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物，来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑多肽等。

内源性杂质是指抗菌药物的自身聚合产物，聚合物既可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时也可产生。对于现在的生产工艺，外源性的高分子杂质已经较少产生，对内源性聚合物的控制是当前抗生素高分子杂质质量控制的重点。

当前75页，总共83页。3.高分子杂质的控制方法

凝胶色谱法（分子排阻色谱法）是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。药物分子进入凝胶孔径内部，保留时间较长。而高分子杂质则被排阻在外，在色谱过程中不被保留，最早被洗脱出来，保留时间较短。

根据β-内酰胺类抗生素和其高分子杂质的分子量，选用SephadexG-10

作为β-内酰胺类抗生素高分子杂质分离色谱系统的凝胶介质。SephadexG-10排阻分子量在1000道尔顿左右。根据β-内酰胺类抗生素在不同离子强度的介质中具有不同表现状态的性质，建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定β-内酰胺类抗生素中的聚合物。此方法已经载入《中国药典》2000-2010年版，用于国产β-内酰胺类抗生素的质量控制。当前76页，总共83页。采用两种流动相：流动相A--pH=7.0的磷酸盐缓冲液，流动相B--纯化水或0.1％十二烷基硫酸钠；凝胶介质：SephadexG-10；检测波长254nm；采用流动相A

：除部分寡聚物外，β－内酰胺类抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，其Kav＝0。采用流动相B：β－内酰胺类抗生素可以形成缔合物，导致其表观分子量增大；此时在Se