白首乌粗多糖对酒精性肝损伤的保护作用研究

白首乌粗多糖对酒精性肝损伤的保护作用研究杨小红，袁江，周远明，张瑜，曾亚翎，刘谋治，赵冰清【内容摘要】目的讨论白首乌〔耳叶牛皮消cynanchumauriculatumroyleexwight〕多糖对小鼠肝损伤的保卫作用。方法从白首乌〔耳叶牛皮消〕中提取粗多糖，将84只健康小鼠动物随机分组，随机分为模型组、生理盐水对照组、阳性对照组和3个实验对照组。实验组每组14只按低剂量组〔100mg·kg-1·d-1〕、中剂量组〔250mg·kg-1·d-1〕、高剂量组〔500mg·kg-1·d-1〕连续灌胃多糖8d，对照组按等量生理盐水灌胃。通过摘眼球取血测量谷丙转氨酶〔ast〕、谷草转氨酶〔alt〕含量。结果白首乌多糖肝损伤防治组小鼠血清alt及ast活性比模型组显著降低，两组比较，差别有统计学意义。结论白首乌多糖对酒精所致小鼠急性肝损伤模型具有显著的保卫作用。【本文关键词语】耳叶牛皮消；粗多糖；酒精；肝损伤abstract：objectivetoinvestigatetheprotectiveeffectofpolysaccharidefrombai-shou-wu(cynanchumauriculatumroyleexwight)onalcohol-inducedliversinthisexperiment,roughpolysaccharidefrombaishouwuwasextractedand84micewererandomlydividedintonormalcontrolgroups,modelcontrolgroup,positivecontrolgroupandthreeexperimentexperimentgrouphad14miceandwerefedpolysaccharidefor8daysbygavagewithrespectivelyhigh-dosageof100mg/(kg·d),middle-dosageof250mg/(kg·d)andlow-dosageof500mg/(kg·d),whilethecontrolgroupsweregiventhesamevolumeofphysiologicalconcentrationoftheserumgpt/altandgot/astweremeasuredbyextractingtheeyeballstheactivityoftheserumgpt/altandgot/astintheexperimentgroupdecreasedmoresignificantlythanthatinmodelcontrolgroup,andthedifferenceswerestaticallysionpolysaccharidefromcynanchumauriculatumroyleexwighthassignificantprotectiveeffectonethanol-inducedliverinjuryinmice.keywords：cynanchumauriculatumroyleexwight;polysaccharide;alcohol;liverinjury白首乌为祖国传统中药，其重要来源为萝藦科植物耳叶牛皮消cynanchumauriculatumroyleexwight，隔山消cynanchumwilfordii(maxim.)hemsl和戟叶牛皮消cynanchumbungeidecne.的块根，具有养血益肝、固肾益精、乌须黑发和延年益寿的成效［1，2］。现代研究发现白首乌中含有多种有效成分，具有抗肿瘤、抗衰老和保肝等多方面的药理活性［1，3］。国外的研究也证明了这些药理活性［4～6］。1器材1.1药品与试剂白首乌购自江苏滨海，经湖南省药检所方石林教授鉴定为萝摩科植物耳叶牛皮消cynanchumauriculatumroyleexwight，实验用酒精〔ar〕，谷草转氨酶(alt)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。谷丙转氨酶酶(ast)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。氯仿、丙酮、乙醚、正丁醇均为分析纯。护肝片为北京亚东生物制药生产。1.2仪器与设备电热恒温枯燥箱〔天津市泰斯特仪器〕202－3ab型；电热恒温水浴锅〔天津市泰斯特仪器〕dk－98-1a；真空旋转蒸发器〔上海亚荣生化仪器厂〕re52－99；抽滤机〔郑州长城科工贸〕shb－b95型；离心沉淀机〔上海医用分析仪器厂〕lxt－ii；分析天平〔湘仪天平仪器厂〕tg328b。1.3实验动物icr小鼠(长沙市开福区实验动物科技效劳部提供,动物合格证号：湘000468)。1.4实验数据处理软件实验数据均在lenovo-compatiblepc机windowsxp系统下采取excel2003进行计算和统计学处理，并用t-test来分析组间差别的显著性。结果以±s表示。文字处理软件用microsoftword2003。2方法2.1多糖的提取分离2.1.1预处理脱脂取60g白首乌cynanchumauriculatumroyleexwight粉末,加180ml乙醇(85%),加热回流1h，过滤，滤渣于恒温箱中80℃枯燥过夜［2］，得淡黄色滤渣52.5g。2.1.2初多糖的提取浸提将黄色滤渣52.5g均分于两个1000ml圆底烧瓶中,a瓶为26.2g，b瓶为26.3g。a、b瓶各加520ml水,在恒温水浴中回流1h，过滤，滤渣在一样条件下反复浸提1次，合并滤液。离心：将两次浸液离心机离心10min(2500r/min)，合并滤液。减压浓缩：将合并滤液在真空旋转蒸发器中浓缩至75ml。真空枯燥：在浓缩后的多糖溶液中参加3倍量95％乙醇〔ar〕225ml，抽滤，真空枯燥后得淡黄色粗多糖。2.2粗多糖的纯化2.2.1脱蛋白粗多糖加蒸馏水200ml复溶后经过sevag试剂(氯仿20ml，正丁醇4ml)除蛋白，连续操作4次,得150ml多糖溶液。2.2.2醇沉在脱蛋白后的多糖溶液中参加3倍95％乙醇，沉淀用乙醇洗涤3次，经抽滤、真空枯燥后得到浅灰色粉末状结晶。2.2.3纯化将灰白色结晶用乙醇、丙酮及乙醚反复洗涤，抽滤、真空枯燥后得到浅灰色粉末状结晶。2.3多糖的验证2.3.1多糖检测反应取多糖粉末少许用蒸馏水溶解，取1ml于试管中，再加10%α-萘酚的乙醇溶液3滴，均匀混合，沿管壁加浓硫酸1ml，使集于下层，在两层接壤面有棕色环出现，证明此为多糖。2.3.2水解取上述粉末20mg置锥形瓶内，参加2mol／l的硫酸甲醇溶液2ml，封口，置85℃水浴中水解24h，冷却，用饱和ba(oh)2中和，离心，取上清液，减压浓缩至干，待用。2.3.3单糖组分的纸色谱层析用微量点样器分别取样品水解液和标准葡萄糖液各4～5μl，在纸色谱上点样，置于展开筒中展开，展开系统为:正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)上层,天然风干后用邻苯二甲酸苯胺显色，样品水解液出现4个棕色点，如此图1，其中有一个点与标准葡萄糖溶液的点rf值一样,说明样品中确含多糖。2.4药理实验2.4.1动物分组取84只icr健康小鼠〔雌雄各半〕，随机分为6组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组，多糖低、中、高剂量给药组(500，250，100mg/kg)。2.4.2给药实验室适应性饲养7d后，浏阳河酒灌胃0.5ml/只。多糖高、中、低剂量给药组分别按500，250，100mg/kg灌胃提取的精制耳叶牛皮消cynanchumauriculatumroyleexwight多糖溶液；阳性对照组按80mg/kg灌胃护肝片溶液；正常对照组和模型对照组等体积生理盐水灌胃，1次/d，2.0ml/只，连续8d。第8天摘眼球取血分离血清［6］。2.4.3取血采取摘眼球取血方法，每只试验用小鼠各取血1ml于肝素润洗过的1.5ml中。2.4.4分离血清将离心管置高速离心机中3000r/min离心10min，用微量打针器提取血清置肝素润洗过的0.5ml离心管中，置-30℃冷冻保存备用。2.4.5生化检测按试剂盒说明测定谷草转氨酶〔alt〕，谷丙转氨酶〔ast〕活性［7］。2.4.6统计学处理数据以±s表示，用t检验来分析组间差别的显著性。p0.05以为有统计学意义。3结果耳叶牛皮消多糖溶液对酒精引起小鼠急性肝损伤血清alt，ast活性的影响。结果见表1。表1耳叶牛皮消多糖对酒精诱导的急性肝损伤小鼠血清中alt，ast的影响〔略〕4讨论多糖中、高剂量均可使小鼠酒精肝损伤血清alt，ast升高的水平降低。模型对照组alt，ast活性较正常对照组明显升高(p0.01),说明酒精致小鼠肝损伤造模成功。多糖低剂量组与模型组对照比较，p0.05,不能说明有显著差别,说明低剂量组对酒精性肝损伤有一定的保卫作用，但作用效果不明显。多糖中剂量组，高剂量组与模型组比较，p0.01，有显著差别，说明多糖中浓度(250mg/ml),高浓度(500mg/ml)均对酒精性肝损伤有很好的保卫作用。高剂量组与阳性对照组比较，p0.05,有差别，说明多糖高浓度(500mg/ml)具有与护肝片一样的对酒精性肝损伤有很好的保卫作用，以至效果更好。实验结果显示，模型对照组alt，ast活性显著高于正常对照组，表示清楚酒精诱导的急性肝损伤模型成功(p0.01)。多糖中剂量组，高剂量组与模型对照组比较有显著性差别〔p0.05〕,说明此剂量下的耳叶牛皮消多糖溶液能显著降低由酒精引起急性肝损伤小鼠血清alt和ast活性的升高，且存在剂量效应关系。多糖高剂量组与阳性对照组比较，效果差别不大，以至能够说更好，具有很大的潜力，值得深切进入研究，必能成为更好的保肝护肝药。固然多糖高剂量组与中剂量组降低ast活性的效果相当，但他们降低alt活性的效果却有一定差距,多糖低剂量组对ast和alt活性的降低有一定效果,但都不明显。从这里能够看出，耳叶牛皮消多糖溶液的浓度与降低ast和alt活性的效果之间有一定的联络，什么浓度效果最佳，其确切保肝作用机制还需要进一步研究。本次实验从alt，ast活性的角度下手，研究白首乌多糖溶液的保肝护肝作用，经实验证明耳叶牛皮消多糖溶液具有保肝护肝的作用。【以下为参考文献】［1］赵冰清，张为，周源，等.瑶药白首乌的研究进程［j］.时珍国医国药，2006，17(3)：6882.［2］徐凌川，梁传东，吴明燕，等.白首乌糖类的提取及含量测定［j］.山东药大学学报，2003，27(3)：215.［3］尹家乐，李心，张士侠，等.白首乌c_(21)甾体酯苷对小鼠急性四氯化碳肝损伤的保卫作用［j］.安徽医药，2007，11(3)：198.［4］wangh，wangq，srivastavarkgongss;etal.effectsoftotalglycosidesfrombaishouwuonhumanbreastandprostatecancercellproliferationaltern［j］.therhealthmed，2003，9(5):62.［5］leemk,yeoh，kimj，eteofpharmacy;seoulnationaluniversity,koreaprotectionofratnepat