河北省未治疗患者体内HIV毒株耐药基因检测研究

河北省未治疗患者体内HIV毒株耐药基因检测研究河北省未治疗患者体内hiv毒株耐药基因检测研究【本文关键词语】hiv;未抗病毒治疗;基因型耐药性【内容摘要】目的研究河北省未承受抗hiv治疗患者体内hiv毒株耐药突变情况，为开展临床抗病毒药物治疗和制订合理的用药方案提供数据支持。方法rtpcr技术扩增hivpol区基因，双脱氧法测定hiv基因序列，并使用contigexpress软件处理原始核苷酸序列，与stanfordhivdrugresistancedatabase()进行比照分析耐药突变情况。结果10例患者hiv毒株基因亚型分析结果均为b亚型。发现存在大量逆转录酶和蛋白酶抑制剂继发耐药变异。结论河北省未治疗患者体内hiv继发耐药变异的存在提示要及早进行耐药检测，适时调整治疗方案。【本文关键词语】hiv;未抗病毒治疗;基因型耐药性studyofgenotypicantiretroviralresistancetestingofhivstrainsinuntreatedhiv/aidspatientsinhebeiprovincezhaohongru,luxinli,zhaocuiying,etal.hebeicenterfordiseasepreventionandcontrol,shijiazhuang050021,china【abstract】objectivetostudythedrugresistancemutationsofhiv1strainsinuntreatedhiv/aidspatientsinhebeiprovince,andtoprovidethebaselinedataforclinicalantiviraltreatmentandsuitabletherapeuticsthepartialpolsequenceswereamplifiedbyrtpcr,thenthegenesegmentwassequenced.theresultsofhivgenicsequenceweretreatedbycontigexpressandwerecomparedwiththestanfordhivdrugresistancedatabasetoanalyzethestateofhivdrugresisitance.results(1)phylogeneticanalysisindicatedthathivgenicsubtypesof10patientswereclassifiedassubtypeb.(2)lotsofsecondarymutationswererelatedwithrtinhibitorandpiinhibitor.conclusiontheresultsrevealsthatuntreatedpatientswithhivhaveacquiredmanysecondarymutationsintheirprandrtgenes,whichsuggestsustopaymuchattentiontothedetectionofdrugresistancemutationsandtheadjustmentofsuitabletherapeuticscheduleintime.【keywords】humanimmunodeficiencyvirus;non-antiviralteatment;genotypicantiretroviralresistance抗逆转录病毒药物的广泛应用，十分是高效抗逆转录病毒治疗(haart)能有效抑制hiv感染者体内病毒复制，改善临床症状，延长命命。但hiv耐药突变所导致的穿插耐药和多重耐药严重降低了hiv治疗效果[1，2]。随着中国艾滋病患者的迅速增长，将会有越来越多的患者承受haart治疗，耐药变异研究日显主要。由于hiv1基因的高度变异性以及耐药性毒株的传播，未经抗病毒治疗的患者可以能携带耐药性hiv毒株。为此本研究选取河北省10例未经抗病毒治疗的hiv/aids患者进行了蛋白酶和逆转录酶的基因型耐药突变分析。1对象与方法1.1研究对象10例hiv/aids患者来源于河北省，均未承受抗病毒治疗。经省艾滋病确证中心实验室westernblot(wb)试验确证为hiv阳性，病毒载量≥1000copy/ml。10例患者按中国1996年发布的〔hiv/aids诊断标准及处理原则〕(gb160001995)病例分类及扩大的诊断标准分为艾滋病期(cd4+t淋巴细胞200/μl)和无症状期(cd+4t淋巴细胞≥200/μl)。1.2标本收集与处理用edta3k抗凝采血管收集hiv/aids患者外周静脉血,采血时间为2008年4月，取抗凝血50μl测定cd+4t淋巴细胞数,剩余全血经离心分离血浆后-80℃冻存。1.3cd+4t淋巴细胞测定用美国bd公司的流式细胞仪(facscount)测定cd+4t淋巴细胞绝对值。1.4hiv载量测定采取rtpcr方法，使用美国roche公司的cobasampllcor自动载量仪及配套试剂盒测定病毒载量。测定的病毒载量数值以病毒载量的lg计算。1.5hiv1rna提取采取德国qiagen公司qiaampviralrnaminikit提取hiv1rna，严格根据说明书进行操作。1.6hiv蛋白酶基因序列和逆转录酶基因序列的扩增引物设计:参照hiv野生株(hxb2,基因库编号k03455)的序列,设计pcr扩增引物。见表1。(2)目的基因片段的扩增:rtpcr反应(逆转录及第一轮pcr):采取takaraonesteprnapcrkit(amv)，严格根据说明书的要求进行操作，使用1.5ml离心管配制rtpcr反应体系。见表2。按每管20μl将配制好的反应体系分装至pcr管中，留意将液体加至管底。将混合物混匀并短暂离心后放入pcr仪中，设定并运行程序(50℃30min;94℃2min;94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，30循环;72℃7min，4℃保温)。第二轮pcr：使用takaraperfectshottmextaqmix试剂盒，根据rtpcr的方法配制50μl反应体系。见表3。将配制好的混合物短暂离心后分装到盛有4μl第一轮pcr产品的pcr管中，混匀后放入geneamp9700dna扩增仪中，设定并运行程序(94℃5min;94℃30s，63℃30s，72℃2.5min，30循环;72℃10min,4℃，保温)。见表3。表1扩增用引物序列和位置表2rtpcr反应体系1.7扩增产品的鉴定利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产品，并以dnamarker(dl2000)作为电泳参照物。见图1。图1pcr扩增结果电泳图谱m:dnamarker(dl2000);n:阴性对照;84～93为标本1.8核苷酸序列测定及分析序列测定由中国科学院艾滋病检测中心李韩平博士完成。使用contigexpress软件做序列拼接处理原始核苷酸序列，参照测序图谱进行基因序列修订后,直接进入stanfordhivdrugresistancedatabase(hivdb.)进行分析。1.9统计学分析应用spss13.0统计软件，计量资料以±s表示，采取t检验，p0.05为差别有统计学意义。2结果2.1hiv载量和cd4细胞数的相关性分析将10例患者共进行53次随访，同时测定其cd4淋巴细胞数和病毒载量值，在42份(79.2%)cd4淋巴细胞计数400个/mm3标本中，有36份(85.7%)hivrna病毒载量103copy/ml。在8份(15.1%)cd4细胞计数200个/mm3的样本中，均可检测到跨越104copy/ml的hivrna病毒载量。然而只要3份(5.7%)血浆样本中cd4计数400个/mm3，其中hivrna病毒载量104copy/ml的样本只要1份，其余2份hivrna病毒载量均小于103copy/ml。结果表示清楚在10例hiv/aids患者的ig(rna)和cd4淋巴细胞数之间显负相关疑(t=-0.487,p0.05)，而且随着cd4细胞数下降越多,病毒载量升高越明显。2.210例hiv/aids患者临床特征10例感染者中男7例，女3例;年龄30～66岁，平均年龄44岁;平均感染时间5年;血液传播8例，门诊患者1例，性途径1例。对pol区测序结果进行hiv亚型分析:结果显示10例感染者均为b亚型。见表4。表410例hiv/aids患者临床特征注：as：无症状2.3逆转录酶(rt)耐药变异10例感染者均不存在rt原发耐药变异，但均存在不同水平的rt继发耐药变异。逆转录酶第103位点变异(k103n)能导致对所有nnrti高度耐药[3],本研究检测到存在k103e/k变异，该变异及其少见，为rt的天然多态性，不会降低任何药效。见表5。表510例hiv/aids患者逆转录酶耐药变异与亚型和疾病进展的情况例2.4蛋白酶耐药变异10例患者中未发现蛋白酶原发耐药变异，但存在大量蛋白酶耐药继发变异k14r[n=1(10%)]、i15v[n=2(20%)]、q18h[n=1(10%)]、l19v[n=1(10%)]、e35d[n=8(80%)]、r41k[n=3(30%)]、l63p[n=8(80%)]、h69r[n=1(10%)]、a71v[n=1(10%)]、i72v[n=5(50%)]、v77i[n=7(70%)]、l89m[n=1(10%)],i93l[n=9(90%)]。未发现明显的亚型特异性耐药变异，蛋白酶耐药继发变异与疾病进展无相关性(p0.05)。见表6。表610例hiv/aids患者逆转录酶耐药变异与亚型和疾病进展的情况例3讨论一般在用药早期出现原发耐药变异，其直接影响抗病毒药物作用靶位点，明显降低一类或一种抗病毒药物药效，以至使其失效，具有药物特异性。继发变异纠正由原发变异导致的复制缺陷，并存储病毒变种的复制能力，提升病毒的耐药性，保卫和促进原发变异的发生[4，5]，适时调整合理的用药方案可使耐药突变率降低30%～50%[6]。因而加强对河北省hiv耐药毒株的检测或监测，以便及时调整用药方案，减少耐药毒株的产生。本研究对河北省未承受过抗病毒治疗的10例hiv/aids患者进行了hiv蛋白酶和逆转录酶耐药变异基因型分析。有研究表示清楚河北省流行的hiv1毒株重要为b亚型，尤其是与血液途径感染hiv有关的人员均为b亚型[7，8]，本次研究的10例hiv/aids患者均为b亚型，与此前的研究结果相一致。所有患者都存在蛋白酶继发耐药变异(k14r、i15v、q18h、l19v、e35d、r41k、l63p、h69r、a71v、i72v、v77i、l89m,i93l)，其出现频率显著高于国外报道[9]。研究证明蛋白酶原发变异与继发变异共存时，能导致蛋白酶抑制剂的穿插耐药和多重耐药[10，11]。在10例患者中没有发现nrti和nnrti相关原发耐药变异，但在艾滋病患者中出现逆转录酶继发耐药变异(v35t、e44ek、k122e、i135iv、i142v、s162c、t200a、q207k、r211kr、k277r、q278e、i293v)，这些变异可能是随着疾病进程产生的天然变异结果。继发耐药变异的广泛存在提示：应及时进行耐药变异检测，及早发现耐药变异，防止多重耐药和穿插耐药出现及流行。【以下为参考文献】1陈志强，梁良，李保军，等.2007年河北省艾滋病病毒耐药检测结果分析.河北医药，2009，31：11291130.2sarmatil,nicastrie,uccellai,etassociatedresistancemutationsinplasmaandperipheralbloodmononuclearcellsofhumanimmunodeficiencyvirustype1infectedpatientsforwhomhighlyactiveantiretroviraltherapyisfailing.jclinmicrobiol,2003,41:17601762.3harriganpr,wynhovenb,montanerj,etonsatreversetranscriptasecodon103:phenotypicresistancetononnucleosidereversetranscriptaseinhibitorandclinicalraltherapy,2003,8:s120.4servaisj,plesseriajm,lambertc,etpiccorrelatesofresistancetohiv1proteaseinhibitorsonlongitudinaldata:theroleofsecondaryrther,2001,6:239248.5gerettialimplicationsofhivdrugresistancetonucleosideandnucleotidereversetranscriptaserev,2006,8:210220.6degruttolav,dixl,d’aquilar,etrelationbetweenbaselinehivdrugresistanceandresponsetoantiretroviraltherapy:reanalysisofretrospectiveandprospectivestudiesusingastandardizeddataanalysisplan.antiviralther,2000,5:4148.7赵翠英，邢