伞状植物叶片中蛋白质的分离纯化及分子质量的测定

伞状植物叶片中蛋白质的分离纯化及分子质量的测定摘要：使用凝胶过滤层析法和考马斯亮蓝法及SDS电泳技术对伞状植物叶片中可溶性蛋白质的含量及相对分子质量进行测定，凝胶过滤表明：随吸光值的不同，蛋白质的含量也不同。SDS-PAGE电泳表明：伞状植物叶片中存在大量相对分子质量为20-110KD的蛋白质。关键词：伞状植物叶片；蛋白质；分离纯化；分子量；凝胶过滤；吸光值；SDS电泳。引言：伞形科植物(Apiaceae，Umbelliferae)一年生至多年生草本，茎中空或有髓。叶互生，叶片分裂或多裂，一回掌状分裂或一回至四回羽状分裂或一回至二回三出式羽状分裂的复叶；叶柄基部膨大，或呈鞘状。花序常为复伞形花序，有时为单伞形花序；花常两性，整齐；花萼和子房结合，裂齿5或不明显；花瓣5；雄蕊和花瓣同数，互生；子房下位，2室，每室有1胚珠；花柱2，基部往往膨大成花柱基(stylopodium)，即上位花盘。果实由2个有棱或有翅的心皮构成，双悬果，每个分果有5条主棱(2条侧棱，2条中棱，1条背棱)，分果背腹压扁或两侧压扁；种子胚乳丰富；胚小。染色体：X＝4-12。本科约800属，3000种，分布于北温带、亚热带或热带的高山上，其中有些种类供药用、食用和观赏用。我国约有90属，500多种，全国均有分布。凝胶过滤(gelfiltration)是分离纯化蛋白质的有效方法之一，有称凝胶排阻层析(gelexclusionchromatography)，分子筛层析(molecularsievechromatography)、凝胶过滤、凝胶渗透层析(gelpermeationchromatography)等，凝胶过滤层析适用于球状蛋白的分离，在过滤时大分子蛋白不能进入凝胶颗粒的内部而随凝胶颗粒的空隙先流出，而小分子可进入凝胶颗粒内部的多空网状结构，流速缓慢，以致最后流出，从而使样品中分子大小不同的蛋白按顺序分开。SDS电泳法（十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法）是测定蛋白质分子量的方法。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。1材料与方法1.1样品采集及处理实验材料采于流泉一社北面污水池（时间：9/11/2021）。材料采回后洗净，用滤纸吸干水分保存备用。1.2试验方法1.2.1蛋白质的提取称取各2g的样品加丙酮石英砂在冰袋上快速充分研磨，将其中一份超声（超4s停8s），另一份冷藏（-20℃）。然后一起在转速为1000的冷冻离心机中离心10min，取上清液加预冷丙酮放置20℃的环境中0.5h，再以同样的转速离心10min，保存一份，在取沉淀加4ml的缓冲液溶解，在5000r/min的离心机中离心10min，取上清液保存备用。1.2.用凝胶过滤层析法[1]分离纯化蛋白质。使用SephdexG-75(分级分离的分子量范围3000—80000)的凝胶装柱（层析柱25×30cm），使胶面平正，用洗脱液平衡，测得流速为2min/管，上样，加超声后的蛋白提取液2mm（柱床体积eq\o\ac(○,1)的1-5%），洗脱流速为4min/管，每1.5ml为一管收集分离纯化液共22管。然后用考马斯亮蓝染色法[2]测蛋白质的吸光值如图1。1.2.3蛋白质相对分子量的测定采用SDS-PAGE电泳[2]进行蛋白质组分分析，分离胶与浓缩胶的配置如表1。取原液和沉淀溶解液及部分分离纯化后的蛋白样液共7组各取50μl分别加50μl还原缓冲液，混合后沸水浴加热3-5min待用。上样量为30μl，电泳是所加Marker为10μl。电泳结束后加入染色液染色24h,之后脱色至蛋白色带清晰为止.最后在凝胶成像仪中拍照,利用蛋白质单向电泳软件进行相对分子量统计分析.结果与分析2.1蛋白质分离纯化的结果由蛋白质的吸光值的曲线可知,蛋白质在280nm下，有大量的吸收，图1中有三个峰值，最大吸光度的峰值为0.526，凝胶过滤时大分子量的蛋白质不能进如凝胶内部，而随洗脱液一起先流出，小分子蛋白进入凝胶内部的多空网状结构而后流出。2.2蛋白质组分分析根据SDS电泳图谱中蛋白质条带可辨颜色的深浅不同（图2）,分离纯化后的杂蛋白减少。不同样液中蛋白质的分子量不同（图3），在原液未超声中包括的蛋白质：94.1754.4640.3315.54KD蛋白，原样超声中包括的蛋白：89.3151.6538.2521.7415.00KD蛋白，未超声的沉淀溶解液中包括的蛋白质：90.9049.8636.9321.7414.2312.13KD蛋白，超声的沉淀溶解液中包括的蛋白质：90.9049.8636.9323.7414.48KD蛋白。凝胶过滤中吸光值最大的中包括的蛋白质：114.3687.7472.2562.7351.6542.5315.54KD蛋白。由表2可看出，蛋白质分子量依次减小，相应的迁移率依次增大，即迁移率与分子量成反比。结合图2与表1在280nm下，分子量大的蛋白含量较多。讨论凝胶过滤层析可以分离纯化蛋白质，使分子量不同的蛋白分开，分子的先流出，小的后流出，凝胶过滤层析是生物化学中一种常用的分离手段，它设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性，广泛用于蛋白质、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。SDS电泳可以测蛋白质的分子量，使其依次分开，而根据分子量的大小可以确定蛋白质。经分离纯化后的蛋白质在SDS电泳上应只有一条，而试验中的有许多条带，说明分离纯化不完全，一条带中有多种蛋白。电泳图谱中的条带较粗，是应为对样品没有浓缩完全。本实验中的伞状植物来源于污水池旁边，拿它可以与标准的对比，比较蛋白质含量的变化，知道污水对伞形科植物中含蛋白质量的影响。图1蛋白质的单项电泳表1分离胶与浓缩胶的配置试剂名称分离胶浓缩胶蒸馏水3.35ml6.24ml凝胶贮液4.0ml1.0ml分离胶缓冲液(Ph=8.9TrisHcl)2.5ml-浓缩胶缓冲液(Ph=6.7TrisHcl)-2.5ml10%SDS0.1ml0.1ml10%TEMED5μl10μl10%AP50μl50μl图2蛋白质的洗脱曲线表2（1）SDS电泳法测的蛋白质的分子量泳道1(标准)泳道2泳道3泳道4条带1迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量条带23220.0034118.4836114.365089.31条带342105.004990.905187.746074.85条带45371.006370.986272.258349.86条带58150.007161.637062.731828.68条带611535.0014915.548151.65条带714216.001789.319242.53条带814915.54表2（2）SDS电泳法测的蛋白质的分子量泳道5泳道6泳道7泳道8条带1迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量条带24990.904990.905089.314794.17条带38448.998349.868151.657854.46条带410036.9310036.939838.259540.33条带512523.7413021.7413021.7414915.54条带615314.4815414.2315115.00条带716312.13参考文献：[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法，生物化学教程，高等教育出版社，2021年6月，P-33。[2]王林嵩，生物化学实验技术，科学出版社，2021年5月，P-25，P-62。[2]王改萍,彭方仁,汤文娟几种木本植物蛋白质的电泳分析2021年4月eq\o\ac(○,1)Vt=Vo+Vi+Vg，其中Vt为柱床体积，Vo为外水体积，Vi为内水体积。

引力波的实验探测给我们的启示摘要：引力理论的发展经历了数百年，从牛顿到爱因斯坦，从万有引力定律到广义相对论。在这过程中，科学家们引力波的预言质疑不休、争论不止。而引力波的实验探测无疑证明了一切。引力波的发现，弥补了爱因斯坦的广义相对论的漏洞，也确定了他的理论的正确。这是人类史上出现的又一契机，它将为人类社会带来重大变革。“破五”是中国传统迎财神的日子。2016年的这一天，却一个让全世界物理学界沸腾的日子，甚至许多的物理学家为之痛哭流涕——被预言已经百年的引力波，终于被探测到了。引力是什么？在今天人们所知道的物质的四种基本相互作用中，引力作用为最弱。四种相互作用按作用强度比例顺序是：强相互作用(1),电磁相互作用(10),弱相互作用(10),引力相互作用(10)。因此，在研究基本粒子的运动时，引力一般略去不计。但在天文学领域内，由于涉及的对象的质量极其巨大，引力就成为不仅支配着天体的运动，而且往往是天体的结构和演化的决定因素。引力并不是一种所谓的“力”，而是一种属性。牛顿在1687年出版的《自然哲学的数学原理》一书中首次提出万有引力定律，基于此，他结识了彗星的运动轨道和地球上的潮汐现象，并根据万有引力定律成功地预言并发现了海王星。万有引力定律出现后，才正式把研究天体的运动建立在力学理论的基础上，从而创立了天体力学。简单的说，质量越大的东西产生的引力越大，地球的质量产生的引力足够把地球上的东西全部抓牢。1905年，爱因斯坦提出狭义相对论，突破了绝对时间和绝对空间的概念，否定了瞬时超距作用，从根本上动摇了建立在这些旧观念基础上的牛顿引力理论。经过十年的探索后，爱因斯坦于1915年提出了迄今为止最成功的近代引力理论——广义相对论。广义相对论中，引力被归咎于时空的弯曲。这种弯曲是由物质造成的，物质的质量越大，所形成的扭曲也就越严重。但是这种弯曲，对于人类来说根本感知不到，一是因为人类伴随这种弯曲一起弯曲了，而是由于这种弯曲太微小。大质量物体发生的扭曲引起了震动，而这种震动，就是引力波。科学家们通过探测这种时空震荡，来证实引力波的存在。早在1916年，爱因斯坦在广义相对论中就预言了引力波的存在。而科学家们普遍认为，这次LIGO这一发现是爱因斯坦相对论实验验证中最后一块缺失的“拼图”，证实了爱因斯坦广义相对论的正确性，弥补了爱因斯坦的广义相对论的漏洞，验证了已故科学家爱因斯坦的预言。探测的仪器叫做迈克尔逊干涉仪，或是LIGO。LIGO的“两条腿”都有4千米长，最近的一次升级就花去了几十亿美元。LIGO的原理是什么？简单来说是利用光速不变，在同样的直线路程里测试耗时，而通过时间的偏差（尽最大可能排除误差，也是耗资巨大的原因）来判定空间确实存在震动。这样的实验设置基于爱因斯坦的假设：光速不变，是因为以光的视角看，它沿途经过的空间发生了折叠伸缩。可能的引力波探测源包括致密双星系统（白矮星，中子星和黑洞）。在2016年2月11日，LIGO科学合作组织和Virgo合作团队宣布他们已经利用高级LIGO探测器，首次探测到了来自于双黑洞合并的引力波信号。在过去的数十年里，许多物理学家和天文学家为证明引力波的存在进行了大量研究。其中，泰勒和赫尔斯由于第一次得到引力波存在的间接证据荣获1993年诺贝尔物理学奖。到目前为止，类似的双中子星系统已经发现了近十个，但是双黑洞系统却是首次。在实验方面，第一个对直接探测引力波作伟大尝试的人是韦伯。虽然他的共振棒探测器最后没能找到引力波，但是韦伯开创了引力波实验科学的先河，为如今的硕果打下了基础。因为在地面上很容易受到干扰，所以物理学家们也在向太空进军。欧洲的空间引力波项目eLISA（演化激光干涉空间天线）。eLISA将由三个相同的探测器构成为一个边长为五百万公里的等边三角形，同样使用激光干涉法来探测引力波。此项目已经欧洲空间局通过批准，正式立项，目前处于设计阶段，计划于2034年发射运行。作为先导项目，两颗测试卫星已经于2015年12月3日发射成功，目前正在调试之中。中国的科研人员，在积极参与目前的国际合作之外之外，也在筹建自己的引力波探测项目。引力波的实验探测引起了世界范围的轰动，这些探测极其不易，宇宙中发生爆炸性的大事件时产生的引力波，才相对容易探测到，例如黑洞合并、星系合并、超新星爆炸等。100年前，爱因斯坦在预言引力波存在时就曾说：“这些数值是如此微小，她们不会对任何的东西产生显著的作用，没人能够去测量它们。”蔡一夫给出解释：“时间发生得越早，距离越远，越会在宇宙中传播期间被红移。红移指的是由于宇宙本身的膨胀将所有的波动的波长拉直拉平，这样其波动性就难以被探测到。例如，这次LIGO探测到的引力波，是13亿年以前两个大约30个太阳质量的黑洞并合所产生的引力波，振幅之小，是在原子核尺寸的千分之一的尺度。能探测到真的是非常不容易，LIGO实验组的科学家们也是在几十年里经历多次挫折，不断调整方案，改进仪器，才最终探测到的。”所以它的成功探测也标志着在这个领域人类的技术进步到了前所未有的水平。而它所具有的里程碑意义不止在科学情感上，更在于能够打开人类的一个新的世界——每个人都对它满怀期待。如果电磁波探测是人类的眼睛，那么人类又多了一双聆听外界的耳朵。马克斯·普朗克引力物理研究所说：“在《星际穿越》和《三体》中，都不约而同地将引力波选为了未来科技发达的人类的通讯手段，这也许只能是美好的幻想，但对于天文研究而言，引力波的确开启了一扇新的窗口。吹进来的第一缕清风，就带来了一个重大的信息：极重的恒星级双黑洞系统存在并可以在足够短的时间（10亿年）内并合。这是让我们始料未及的。谁能知道在将来的更多的探测中，LIGO和一众引力波探测器能带给我们什么样的惊喜呢？”引力波有两个非常重要而且比较独特的性质。第一：不需要任何的物质存在于引力波源周围。这时就不会有电磁辐射产生。第二：引力波能够几乎不受阻挡的穿过行进途中的天体。比如，来自于遥远恒星的光会被星际介质所遮挡，引力波能够不受阻碍的穿过。对于天文学家来说，这两个特征允许引力波携带有更多的之前从未被观测过的天文现象信息，而每一个电磁波谱的打开，都会为我们带来前所未有的发现。天文学家们同样期望引力波也是如此。而引力波本身的性质也可能对基础物理学产生巨大的影响。另外，引力波蕴含的，很可能是宇宙诞生的画面。我们从小都被告知一个最著名的猜想——宇宙是在一场爆炸中诞生的。这意味着，在时空的开始，宇宙又一次最为剧烈的震动。引力波就能让我们还原这个震动——它是否存在？有多大规模？不仅如此，引力波还能传递信息——我们看不到的宇宙空间在发生什么？据科学家解释，这次的引力波就是在遥远的距离上巨大的黑洞变化引起的。而这一结果也证明了黑洞真实存在——至少是广义相对论预测的由纯净、真空、扭曲时空组成的完美圆形物体。并且，引力波传递的信息可以让科学家更精确地估计宇宙膨胀的速度。总而言之，一个新的重大科学发现，总会给人类社会带来无法预估的发展。18世纪面熟电磁波的麦克斯韦理论确认的时候，也没人知道会给人类带来什么，但是现在不管是电视机还是移动电话，都与电磁现象有关。引力波的发现类似当年的发现X光一样，是一种工具。有了这个工具，我们可以利用引力波的观察，去观察遥远的宇宙的现象。发现暗物质、时空穿梭等等才是有可能实现的事情。如果没有引力波，以我们现有的技术是做不到这些科幻世界才有的事情的。“既然引力波是存在的，基于引力波的科研思路可信性就大大提高了。就好像走一条未知的路，走到半路，有人怀疑不对，结果证实是对的，那么就可以加快步伐了。”苏萌说。世界各国都加大了探测研究引力波的力度，我国也紧跟探索引力波的步伐。“天琴计划”参与者、中山大学天文与空间科学研究院院长李淼教授介绍，“天琴计划”是我国自主开展空间引力波探测的可行方案，发射三颗卫星探测引力波，该计划预期执行期为2016~2035年，分四阶段实施。项目还将挖山洞，建观测站以及建设综合研究大楼。预计拟投三亿启动。天琴计划预期执行期为2016-2035年，分四阶段实施：（1）2016-2020年：完成月球/深空卫星激光测距、空间等效原理检验实验和下一代重力卫星实验所需关键技术研发。主要研发成果包括：新一代月球激光测距反射器、月球激光测距台站、高精度加速度计、无拖曳控制（包含微推进器）、高精度星载激光干涉仪、星间激光测距技术等；（2）2021-2025年：完成空间等效原理检验实验和下一代重力卫星实验工程样机，并成功发射下一代重力卫星和空间等效原理实验卫星。主要研发成果包含：超静卫星平台、高精度大型激光陀螺仪以及进一步提高加速度计、无拖曳控制、高精度星载激光干涉仪、星间激光测距等技术；（3）2026-2030年：完成空间引力波探测关键技术，完成卫星载荷工程样机；（4）2031-2035年：进行卫星系统整机联调测试、系统组装，发射空间引力波探测卫星。李淼介绍，“天琴计划”的出发点是切实根据我国的技术能力实际和未来几十年的发展前景，提出我国自主开展空间引力波探测的可行方案。在目前讨论的初步概念中，天琴将采用三颗全同的卫星构成一个等边三角形阵列，每颗卫星内部都包含一个或两个极其小心悬浮起来的检验质量。卫星上将安装推力可以精细调节的微牛级推进器，实时调节卫星的运动姿态，使得检验质量始终保持与周围的保护容器互不接触的状态。这样检验质量将只在引力的作用下运动，而来自太阳风或太阳光压等细微的非引力扰动将被卫星外壳屏蔽掉。高精度的激光干涉测距技术将被用来记录由引力波引起的、不同卫星上检验质量之间的细微距离变化，从而获得有关引力波的信息。“天琴”的卫星将在以地球为中心、高度约10万公里的轨道上运行，针对确定的引力波源进行探测。这样的选择能够避免测到引力波信号却无法确定引力波源的问题。中国科学院也于2016年2月16日公布了空间引力波探测与研究的“空间太极计划”。按照这一计划，我国将在2030年前后发射由位于等边三角形顶端三颗卫星组成的引力波探测星组，用激光干涉方法进行中低频波