DATS和辛伐他汀对骨肉瘤细胞的作用及机制研究

DATS辛伐他对骨肉瘤胞的作用及制研究第一部分DATS对骨肉瘤细胞的作用及机制研究研究背景骨肉瘤是最常见的起源于骨骼系统的原发性恶性骨肿瘤,主要发生于儿童和青少年中。肺转移是骨肉瘤最常见的早期转移部位,也是导致死亡的重要原因。目前骨肉瘤的标准治疗方式是术前的新辅助化疗,手术切除,术后辅助化疗。然而,即使采用了广泛的外科手术切除及高强度的辅助化疗方案大约35-55%的初诊局限肿瘤患者会出现肿瘤复发或转移化疗耐药的出现和化疗的副作用进一步影响了骨肉瘤治疗的效果。因此需要继续开发新的治疗药物来进一步提高骨肉瘤治疗的效果并改善预后。大蒜素是从大蒜的鳞茎中提取的天然有机硫化(organosulfurcompounds,OSCs),是多种具有挥发性的烯丙基硫化物的混合物主要成分包括二烯丙基一硫化物(diallyl二烯丙基二硫化物(diallyl、二烯丙基三硫化物(diallyltrisulfide,DATS)大蒜烯(Ajoene)。近年来,流行病学研究中发现大蒜的摄入量与某些肿瘤的发生呈负相关很多体内和体外实验也证实了大蒜素具有明显的抗肿瘤活性在大蒜素的各种活性成分中,DATS显示出了相比其他几种成分更强的抗肿瘤特性是一种潜在的抗癌药物。既往研究显示对胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌具有明显得抗肿瘤作用。然而,DATS对骨瘤的作用及机制研究尚不充分。本研究中我们应用骨肉瘤细胞系和MNNG/HOS种细胞作为研究对象研究DATS对两种细胞的作用及可能涉及的分子机制,以期为DATS于治疗骨肉瘤提供了理论依据。研究目的1.观察对骨肉瘤细胞的作用。2.探寻DATS抑制骨肉瘤生长的可能作用机制。研究方法1.应用不同浓度的处理骨肉瘤细胞MG63和

MNNG/HOS后,用CCK-8法检测骨肉瘤细胞细胞活性,分析对骨肉瘤细胞增殖的影响。2.应用不同浓度DATS孵MG63MNNG/HOS胞48h后倒置显微镜下观察细胞的形态学变化,观察DATS对骨肉瘤细胞的形态学影响应用细胞周期检测试剂盒检测DATS处理骨肉瘤细MG63和MNNG/HOS的细胞周期分布变化观察DATS对骨肉瘤细胞周期分布的影响。应用WesternBlot检测细胞周期相关蛋白cyclinD1、p21、p27的表达,分析DATS诱导骨肉瘤细胞周期阻滞的可能分子机制。4.应用细胞凋亡检测试剂盒检测处理骨肉瘤细胞MG63和后的细胞细胞凋亡比率,观察DATS对骨肉瘤细胞凋亡的影响。5.应用荧光探针DCFH-DA通过荧光显微镜和流式细胞仪检测诱导MG63和MNNG/HOS细胞内活性氧(ROS)变化水平。6.应用荧光探针JC-1测DATS处理后的骨肉瘤细胞MG63和MNNG/HOS的线粒体膜电位变化。7.DATS处理MG63和MNNG/HOS细胞后,提取总蛋白,应用WesternBlot检测PI3K/Akt信号通路中PI3Kp110β、PI3Kp85α、Akt、phosoho-Akt表达及下游分子Bad、Bax、Bcl-2Bcl-XL的表达,检测线粒体凋亡通路中c、caspase-9、caspase-3、cleavedPARP蛋白表达变化。分析DATS导骨肉瘤细胞凋亡的可能分子机制。实验结果1.DATS对骨肉瘤细胞MG63和MNNG/HOS的活性抑制作用随药物浓度和处理时间的增加而增强。DATS对MG63细胞活性有着更强的抑制作用2.DATS处理细胞后,导致骨肉瘤细胞发生明显的形态变化DATS诱MG63和MNNG/HOS细胞发生周期阻滞,抗氧化剂NAC能够逆转DATS诱导的周期阻滞。

DATS处理骨肉瘤细胞后蛋白表达下调,而p21和p27蛋白的表达明显上调。4.DATS能以剂量和时间依赖的方式诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。NAC预处理细胞后可逆转DATS诱导的凋亡。5.DATS作用MG63和MNNG/HOS16h后,细胞内ROS水平明显增加。DATS随着浓度增加和作用时间延长而明显增加骨肉瘤细胞内水平NAC则完全消除了ROS的增加。6.DATS作用骨肉瘤细胞后,线粒体膜电位水平发生明显下降,NAC对抗DATS对线粒体膜电位的破坏作用。7.DATS作用后骨肉瘤细胞内PI3Kp11o,PI3Kp85a,和p-Akt的蛋白表达呈现与剂量相关的下降。同时和Bax表达上调,而Bcl-2和Bcl-XL表达下调,细胞内及活化的caspase-9和caspase-3水平,cleavedPARP蛋白表达明显增加。说明DATS通过下PI3K/Akt路和激活线粒体凋亡通路诱导骨肉瘤细胞凋亡时,DATS对PI3K/Akt信号通路起到了PI3K/Akt号通路抑制剂LY294002的类似作用,而LY294002和DATS共同处理细胞时起到了明显的协同抑制作用。NAC完全逆转DATS对PI3K/Akt通路蛋白的下调说明DATS诱导的骨肉瘤细胞MG63和MNNG/HOS凋亡是依赖于ROS增加导致的信号通路下调起作用的。结论1.DATS具有明显的抑制骨肉瘤细胞生长的作用DATS通过增加ROS的产生及下调cyclinD1、上调p21和p27蛋白表达而诱导骨肉瘤细胞周期阻滞。3.DATS通过诱导ROS产生导致骨肉瘤细胞线粒体膜电位水平下降。4.DATS通过增加增加诱导骨肉瘤细胞凋亡,其分子机制可能与依赖的PI3K/Akt信号通路下调及线粒体凋亡通路活化有关。第二部分辛伐他汀对

骨肉瘤细胞的作用及机制研究研究背景骨肉瘤是主要发生于青少年人群的最常见的原发性恶性骨肿瘤,是青少年肿瘤致死的主要原因之一。即使采用了广泛的外科手术切除及新辅助化疗方案,目前骨肉瘤的治疗效果仍然较差,5年生存率在过去二十年来并未得到明显的提高。因此,研究或开发新的治疗骨肉瘤的有效药物迫在眉睫。他汀类药物是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeA,HMG-CoA)原酶的竞争性抑制剂,而HMG-CoA还原酶是人体内内源性胆固醇合成的限速酶。他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的活性能够有效的减少细胞内胆固醇的合成,从而降低血液中的胆固醇水平。近阶段以来,他汀类药物的抗肿瘤作用获得了越来越多研究者的注意并且被证实能够抑制多种肿瘤的生长,促进其凋亡诸多的他汀类药物中,辛伐他汀在体内体外和动物实验中显示出了相较其他同类药物更强的抗肿瘤特性之前的体外研究证实,辛伐他汀能有效的抑制卵巢癌、胆管癌、肾癌、前列腺癌和肝癌的生长,其主要的抗肿瘤机制是诱导凋亡及周期阻滞。然而,辛伐他汀对骨肉瘤的作用目前研究较少其抗骨肉瘤效果及机制文献报道不多。本研究将通过一系列方法检测辛伐他汀对骨肉瘤的作用并探寻可能涉及的分子机制,为辛伐他汀治疗骨肉瘤的可能前景提供理论依据研究目的1.观察辛伐他汀对骨肉瘤细胞的作用。2.探寻辛伐他汀抑制骨肉瘤生长的可能信号通路及分子机制。研究方法应用不同浓度的辛伐他汀处理骨肉瘤细胞MNNG/HOS24h,48h,72h后用CCK-8法检测骨肉瘤细胞细胞活性,分析辛伐他汀对骨肉瘤细胞增殖的影响。2.应用细胞划痕实验(愈伤实验)检测辛伐他汀处理骨肉瘤细胞后的细胞迁移距

离,观察辛伐他汀对骨肉瘤细胞迁移能力影响。3.应用底面铺有基质胶的Transwell小室检测辛伐他汀对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。应用WesternBlot检测基质金属蛋白酶(MMPs)MMP-2MMP-9的蛋白表达析辛伐他汀抑制抑制骨肉瘤细胞迁移侵袭的可能分子机制。4.应用细胞周期检测试剂盒检测辛伐他汀处理骨肉瘤细胞后的细胞周期分布变化,观察辛伐他汀对骨肉瘤细胞周期分布的影响。应用WesternBlot检测细胞周期相关蛋白cyclin、CDK2、p21、p27的表达,分析辛伐他汀诱导骨肉瘤细胞GO/G1期阻滞的可能分子机制。应用细胞凋亡检测试剂盒检测辛伐他汀对骨肉瘤细胞凋亡的影响应用Blot检测PI3K/Akt信号通路中PI3Kp-Akt表达及下游的BaxBcl-2、cleavedPARP蛋白表达变化。分析辛伐他汀诱导骨肉瘤细胞凋亡的可能分子机制。应用PI3K/Akt信号通路激活剂IGF-1和特异性抑制剂LY294002不同浓度的辛伐他汀分别或者共同作用MNNG/HOS细胞后,提取总蛋白,检测、Akt、p-Akt的表达及下游的Bax、Bcl-2、cleavedPARP蛋白表达变化,析PI3K/Akt信号通路在辛伐他汀诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用建立骨肉瘤MNNG/HOS胞的动物模型,给予腹腔注射辛伐他汀或生理盐水,定期称量裸鼠体重测量计算移植瘤的体积。观察辛伐他汀对动物模型中骨肉瘤的生长抑制情况。实验结果辛伐他汀以时间和浓度依赖方式抑制骨肉瘤细胞MNNG/HOS增殖。2.辛伐他汀抑制骨肉瘤细胞MNNG/HOS的迁移,并呈剂量依赖性。3.辛伐他汀抑制骨肉瘤细胞的侵袭,并呈剂量依赖性。同时,MNNG/HOS细胞中的MMP-2和MMP-9蛋白的表达明显下降,说明辛伐他汀抑制

骨肉瘤细胞侵袭的分子机制可能与下调MMP-2MMP-9蛋白的表达有关辛伐他汀诱导MNNG/HOS细胞G0/G1周期阻滞。WesternBlot结果显示,细胞内cyclinD1CDK2、CDK4蛋白的表达明显下调,p21和p27蛋白的表达则被明显上调这个结果解释了辛伐他汀诱导骨肉瘤细胞G0/G1周期阻滞的可能分子机制5.辛伐他汀作用后MNNG/HOS细胞凋亡比率明显增加并与剂量正相关。Westernblot结果显示,辛伐他汀作用后和p-Akt(Ser473)蛋白的表达明显下调,而总的表达没有显著变化。同时,Bax的表达增加,而Bcl-2的表达下降,导致Bax/Bcl-2的表达比率明显上升,下游cleavedPARP的表达增加。6.IGF-1通过上调PI3K和p-Akt蛋白的表达而活化PI3K/Akt信号通路,而辛伐他汀与之作用相反,起到了类似于LY294002通路抑制作用,其下游的的表达比率也发生了对应的变化。IGF-1与辛伐他汀共同作MNNG/HOS细胞后辛伐他汀PI3K/Akt信号通路的抑制作用被逆转,证明辛伐他汀诱导凋亡的主要分子机制涉及信号通路的失活。7.成功利用裸鼠建立骨肉瘤细胞的动物模型伐他汀对荷瘤裸鼠的体重及日常活动没有明显