早期和晚期人体恶性肿瘤中循环肿瘤DNA的检测

DNAn,2*k,1*†a.,1*‡Kinde,1* YuxuanWang,1NishantAgrawal,1,2BjarneR.Bartlett,1,3HaoWang,1BrandonLuber,1RhodaM.Alani,4EmmanuelS.Antonarakis,1NiloferS.Azad,1AlbertoBardelli,5,6,7 HenryBrem,2JohnL.Cameron,2ClarenceC.Lee,8LeslieA.Fecher,9,10GaryL.Gallia,2 PeterGibbs,11,12DungLe,1,3RobertL.Giuntoli,2MichaelGoggins,2MichaelD.Hogarty,13MatthiasHoldhoff,1Seung-MoHong,2,14YuchenJiao,1HartmutH.Juhl,15JennyJ.Kim,1GiuliaSiravegna,16DanielA.Laheru,1CalogeroLauricella,16MichaelLim,2EvanJ.Lipson,1SuelyKazueNagahashiMarie,17GeorgeJ.Netto,2KellyS.Oliner,18AlessandroOlivi,2Olsson,19GregoryJ.Riggins,2AndreaSartore-Bianchi,16KerstinSchmidt,1 le-MingShih,2SueliMiekoOba-Shinjo,17SalvatoreSiena,16DanTheodorescu,20 JeanneTie,11TimothyT.Harkins,8SilvioVeronese,16Tian-LiWang,2JonD.Weingart,2ChristopherL.Wolfgang,2LauraD.Wood,2DongmeiXing,2RalphH.Hruban,2JianWu,1,21§PeterJ.Allen,22C.MaxSchmidt,23MichaelA.Choti,2¶VictorE.Velculescu,1|| KennethW.Kinzler,1||BertVogelstein,1||NickolasPapadopoulos,1||LuisA.DiazJr.1,3||位有着不同种癌症患者身上采用基于数字化PCR技术评估)探癌症>75%有着患者内ctDNA可探，但只有不到百分之五十患有原患者可探测到ctDNActDNA的可探率分别73%57%48%50%。ctDNA经常出在没有细胞的患者，暗示这两种生物标记物不同206名转移结肠癌患者组单独实验对象，我们KARS基因突变ctDNA可探率87.2%，且特异性是99.2%。最终，我们在24位对治疗有着客观响应但随后复发的患者身上对ctDNA是否能够提供表皮生长因子受体抑制剂潜在抗性机制的线索进行评估，这些患者中的23人(96%)在涉及促分裂原活化蛋白激酶通路的基因中发展出一个或更多的突变。总之，这些数据暗示ctDNA是一个明显适用的，敏感的和特异的可被用于在有着多种不同癌症的患者身上进行临床和研究目的的生物标记。简介 160人的生物标记适用于们中的分，是在的中(1–6).基于的蛋白生物标记癌抗原-125(CA-125),(CEA)(PSA)(24)期癌症患者体内这些标记并没有被发现相当大程度的增加(56)。随着负责人体癌症产生和发展的基因改变的发现，寻找新一代生物标记成为了可能(711)。随着源自近来癌症基因测序研究的基因信息的汇总，现在已知几乎每一种癌症都有体细胞基因改变。这些改变包括单碱基替换，插入，删除和易位（后者包括那些与基因融合，基因扩增或杂合性缺失的产物）。这些体细胞突变以可忽略的频率发生在普通细胞群体中并因此提供从生物学视角上坎精巧的特定生物标记。肿瘤DNA可以在中被非侵入性的评估：无细胞肿瘤DNA(ctDNA)肿瘤细胞（CTCs）(12,13)ctDNACTCs完整，经是存活的，可通过物化学特性或者区别于其化的细胞(15)量的研究较过同一CTCsctDNA模板(16–，但许多研究已经表明和CTCs都出现在晚期肿瘤中。较这两种的方ctDNACTC成分的解。此外，ctDNA真的可能来自CTCs，但是ctDNA或CTC释放入循系统的机制尚不明确。这一研究的目的之一就是对同一人采用无偏倚方法后较ctDNA和 CTCs在中的含量。ctDNA的研究各自评估有着单型肿瘤的患者。鉴于这些研究中DNA的准备和分析技术有着显著的不同，所以很难去直接较不同肿瘤类型ctDNA的含量(162026较ctDNA测量有效的癌症的光谱，我们在当研究中评估了大量类型的癌症。我们对所有样品使用标准化和肿瘤DNActDNA水平，从而使我们能够报道每个案例每毫升的突变模板数(Fig1).这个方法也可以使我们直接比较两种在循环中发现的最常见的肿瘤特异性遗传学变化形式：单基因替换和重排。最直接的应用之一被术语化为“液体活组织检查”(20).在研究和(27).此外，一旦一个靶向治疗用于有着种瘤的可以常发的或者在性的有肿瘤的时性和治疗的特异性基因变(16,20,21,23,28,52).液体活组织检查的式有于传肿瘤活组织检有在一个的临床组中被用因体癌者(CRCs)一的特异性和敏在最应因体的者发的的基因的用于有不同癌的者，些研究其在的。有着癌的者我们从14种不同组织136癌和41有着发性肿瘤（瘤和细瘤的者发性肿瘤被在因为不通常的。我们同样也10外的，癌（n=7）和细癌（n=3）组，个特的评因为常有并在两种癌中有肿瘤的代些者的临床特被为或基因组测被用中的些晚中，一个基因变—一个点变（151）或者基因重排（36）—被发现在每一个癌研究者中(S1)。除在KRASNRASPIK3CA,和BRAF（众所周知体细中的）些已知热点基因中发基因变的评同一者肿瘤性细的DNA，所有其他基因变被也发在体细中。图并从5ml血浆纯的DNA中可以探到一个变模板。每个的可用血浆数列在S1中。分有着外实体瘤的被研究者被检ctDNA(112/13682%)然而，有着可探的分者因肿瘤种而异(似然比检验P0.001).如图2A和图S2肝水2A的肿瘤型的者数很的，不同型肿瘤比较的计S/AS2SA50A的B0“单碱替换与重排较”只非TP53)被评估观到很程性。局疾我们下步评估局疾体内cDN就本采集间没临床上射线查远端证据所被评估局23名55体内发探3名12名S于自所型充足用本性疾模型拟合及层卡方0.001观值。出49%到78%四局以及86%到100四性3探也与程任何探A234各自是5569823B,萨默斯指等级关浓随程上升。较CTCsCTCss于PCR试被用于识别血液颗粒(CTCs)血液上清液(血浆)重排实以性重排下进行特性点突下进行原讨论我们没识情况下(113个81%没CTCs实被探(2)此外CTCs都三个案血浆突碎片均于50被CTCs似单碱替换与重排较我们也感兴趣于较循环两DNA碎片改项研究实际问题使我们鉴别所讨论，1名特性重排特性点突S个外名TP53循环点突名重排鉴定她的S碎片的绝对数量相对重排是高4S们选择用来分析重排的基因在肿瘤只出现一次。液体活组织检查的敏感性和特异性上述结果是通过首先在肿瘤基因突变然后测定是否有相同可探测突变的方法获得的对特定液体活组织检查的应用肿瘤的基因突变事先未知并且所有相关突变马上标为待测为了测定液体活检方法的敏感性我们盲法评20名有着转移CRCS。这一队病人完全独立于上文提及和S1,S2的410名病人。对每例样本，我们界KARS第12，13位碱基突变是否既在原发性癌又在2ml治疗前抽提出现。KARS基因选突变的出现是使用抗体抑制EGFR来治疗转移性CRC患者的先决条件(29)。我们了69名患者在有着循环突KARS(206人的33%)。128名有着KARS野生型癌症的患者127人没有检测出循KARS性99.2%69， 这 9了06， 是87.2%在和肿瘤组织KARS突变状态一致的比例是并且一致认为是高度显著(k<0.0001).26个临床和病理学S和S4有S没有可探测基因突变相关的的现象是低CEACS和SCE水平也显然与S碎片浓度有关S6与S7。低肿瘤负荷从通常CEA水平体现）A年GPS，和,浓度为预测存活提供了附加价值似然比检验，3。随后我们评估不同A图5浓度的上升存活率稳定下降检测患者的抗性获得基因突变KARS第24名患者38R0但推测起来产生在转移病灶的少量细胞，并在EGFR抑制剂的影响下扩散。这里我们希望确定除了在KARS12，13碱基处的突变外，是否有其他的抗性突变可以在EGFR抑制剂治疗测EGFR通路几个基因已知突变热点：在KARS第和61碱基位点内和周围第和61第599和第712至至至及PIK3CA第538至549和1039至1050碱基位点。24个被评估案例包括17个之前评估过KARS基因突变和7个额外使用EGFR抑制抗治疗，最初应答但随后病程进展（帕尼单抗或九个有着原性癌症案例是不能利用，所以我们使用血浆预处理过DNA去评估是否任一获得性基因突变在EGFR抗使用前都是可探测6列出基因突变没有能在抗治疗前被。在24名我们识别到23在胞外信号调节激酶通路基因有着至少一个自循环识别到不同突变数平均值为区间同一不同突变展为自身多性病变是并不奇怪病变被期望拥有至少一个耐药性突变（20,30）.总共，我们观察到70例在使用EGFR阻断剂之前没有肿瘤或血浆测到（表S8和图一般（7034例）出KARS第12密码子。当这些突变出在原性肿瘤被认为导致了EGFR阻断剂抗性，并被观察到使用EGFR阻断剂后水平提高不论是在内还是外（20,30）。BARF一个突变被观察到。之前几项研究表明BRAFV600E突EGFR（31-33）在EGFR激酶结构域出突变（密码子714和794，表S8和图6）。这些筛留物突变之前在原CRC被观测到，虽然并不经常，同时EGFR阻断剂抗性显示是由EGFR基因遗传学改变所导致（34,35）。我们没有识别在已知PIK3CA基因热点治疗相关突变（外显子9和20）（36）我们研究成最让人惊讶EGFR阻断剂观察是KRAS或NRAS基因61位密码子大量突变（S6和图6）.24位15人（62.5%）6115位拥有所观测到31个突变61位密码子突变出NRASKRAS（S6和图6）.讨论通过所研究640DNA碎片相对较多集在转移性水平。这些结果有着多种可解读含义以及为将来研究建议了重要途径。测晚期癌症疾病一个遗传性改变可以在这部分研究评估410位肿瘤被识别，使得与既在普通细胞又在肿瘤细胞表达CEA或CA19-9蛋白质不同，克隆性的5所示，有着相当低期乳腺癌患者被报道（16）。尽管这些优点使得它对于监控患者是很有前途的，但也有潜的局限性。特异的突进行同样可被方法论的比较DNA（CTCs和两种类型的的研究得到了混合的结论。举例来说，一个小组得的少于CTCs的结论（17）；这一组使用体CTCs但是并没有使用但是使用了几乎不敏感的方的水平远高于CTCs（19）本与CTCs。我们仅把细胞性成分与血浆分离并鉴定细胞部分或细的分离CTC纯化效率的技术问题被排除。来自CTCs和的DNA间的比较并不能简单地通过点突来展，因为基于PCR实验的点突的探测。因为每毫升血液有几百万普通细胞但有几个CTCs数百万野生型模板分子一个突可以被稳定的探测；PCR错误并不会形成特定的重排。16名患者13人的水平非常高