2016实验仪器复习题

1简要说明流式细胞术的基本原理检测的原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统（透镜、光阑、滤片和检测器等）收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号，计算机软件系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析第一页，共27页。2

简述流式细胞术中细胞分选系统的原理？

分选的原理：流式细胞仪把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液滴，一部分液滴中含有细胞，而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其它处理，做更深入的研究第二页，共27页。质谱流式细胞技术（MassCytometry）与传统流式细胞技术相比，其主要有两点改进：①标签系统的不同：前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签，后者则使用各种金属元素作为标签；②检测系统的不同：前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段，而后者使用ICP质谱技术作为检测手段第三页，共27页。第四页，共27页。3简述AnnexinV-PI法检测细胞凋亡的原理？

AnnexinV是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于结合到磷脂类如磷脂酰丝氨酸（PS）的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。PI不能透过完整的细胞膜，但当细胞膜破损时可通过进入细胞内。因此，可以建立一种用AnnexinV结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法第五页，共27页。●实时在线监控

对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期●降低反应的非特异性

使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性●增加定量的精确性

全程监控，定量与扩增同步进行,准确的进行定量●

结果分析更加快捷方便，无需跑胶●

重复性好、测定偏差小4定量PCR与定性PCR比较具有何优势？第六页，共27页。5定量PCR中Ct值的确定CT值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经过的循环数。待测基因浓度越高，则该样本会越早进入扩增对数期，相反浓度越低则后进入对数期，所以Ct值的高低与样本里面待测基因的浓度呈反比关系第七页，共27页。6实时荧光定量PCR定量分析目的基因的方法实时荧光定量PCR对待测样本中目的基因可进行绝对定量即精确定量，也可进行待测样本中目的基因相对于对照样本表达量有无改变、改变量的多少的相对定量绝对定量是将目的基因精确标化了的标准品进行倍比稀释以后，利用标准品的浓度梯度和Ct值绘制标准曲线，再利用标准品的标准曲线和待测样本中目的基因的Ct值计算该待测样本中目的基因的浓度相对定量是相对于对照样本（参照物）表达量的改变。常用的分析方法有双标准曲线法和△△Ct法。双标准曲线法分析时要对待测目的基因和管家基因同时做标准曲线，从而分析待测样本中目的基因相对于对照样本表达量的改变。△△Ct法是在双标准曲线分析法确定待测目的基因和管家基具有相同的扩增效率的前提下，利用对照样本和待测样本中待测目的基因和管家基因的Ct值的差值来比较分析待测样本中目的基因相对于对照样本表达量的改变

第八页，共27页。7WesternBlotting检测目标蛋白质的原理WesternBlotting是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性、定量方法。该方法需要将组织或细胞裂解后使释放出来的蛋白质通过SDS电泳进行分离，然后将凝胶中分离开的蛋白质平行转印到NC或PVDF膜等固相载体上再与相应的特异抗体发生免疫反应。可用来确定同一蛋白质在不同细胞或同一细胞在不同条件下的相对含量。由于其检测往往需要抗体与转印到膜上的特定的目的蛋白相结合，所以被称为免疫印迹技术第九页，共27页。8简述Sanger双脱氧链终止法DNA测序的原理

在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列第十页，共27页。9如何对测序报告进行简单解读及对核苷酸序列进行初步的分析

删除载体及附加序列寻找基因根据开放读码框利用软件预测或确定基因的起始密码子、信号肽、终止密码子及3’端的确认、非编码序列、内含子、密码子偏爱性、外显子--内含子边界、上游控制顺序等确定转录起始位点区，即mRNA的5’端利用生物信息学及相关软件和互联网查询或比较其同源性确定DNA顺序中基因的位置及其在基因组中的功能第十一页，共27页。10什么是激光共聚焦显微镜？有何主要用途？定义：利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器主要用途：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光、激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用第十二页，共27页。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。用预先固化在argarosebeads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀蛋白A，那么与蛋白A在体内结合的蛋白B也能一起沉淀下来。通过蛋白变性分离，对蛋白B进行检测，以证明两者间的相互作用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗原和抗体的特异性作用为基础、用于研究蛋白质相互作用和确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法11免疫共沉定技术的原理及优缺点第十三页，共27页。优点

相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态

蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可避免人为干扰

可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物局限性

可能检测不到低亲和力和瞬间作用的蛋白质-蛋白质相互作用

两种蛋白质的结合可能非直接结合，而是由第三者在中间起桥梁作用

须在实验前预测目的蛋白，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果第十四页，共27页。第十五页，共27页。12染色质免疫沉淀技术的原理是什么？Co-IP和ChIP两者有何区别？

染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）的原理：在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的DNA片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息CHIP-seq：染色质免疫共沉淀-测序技术ChIP-chip：染色质免疫共沉淀-芯片技术RIP：用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合第十六页，共27页。Co-IP与ChIP的区别第十七页，共27页。第十八页，共27页。13简述电镜样品取材时的注意事项

快

在动物停止心跳后0.5分钟到2分钟内取材完毕，若为活检取材，也应尽速取下材料，将取出的材料立即浸入2.5%-3%戊二醛固定液中，取材时间最长不应超过10分钟

小

由于电镜所用固定剂穿透力很弱，因此取出的组织大小应在0.5-1mm之内，一般不允许大于1mm3

准

由于电镜观察范围的局限性，在透射电镜样品取材时准确是最为重要的

低温操作

生物样品取材时一般要求在4℃左右的低温下操作避免损伤

常规透射样品、扫描样品多采用用1/15M或0.1MPBS液配置的2.5%-3%的戊二醛固定液第十九页，共27页。14常见的电子显微镜种类及其特点常见的电镜种类为透射电子显微镜、扫描电子显微镜及分析电子显微镜

透射电子显微镜利用直接透射电子和部分弹性散射电子成像，观察生物样品细胞内部超微结构，所观察的样品为厚度100nm范围内的超薄切片第二十页，共27页。扫描电子显微镜是利用样品本身所产生的二次电子成像，主要观察生物样品表面的立体形貌分析电子显微镜是一种复合式电子显微镜，通常是在扫描电子显微或透射电子显微镜基础上外加辅助装置，如特征X线分析仪，俄歇电子分析仪，能谱仪等，这样在观察样品内部结构或样品表面立体形貌的同时又可对该样品所含元素成份进行分析第二十一页，共27页。15举例说明透射电镜在临床病理诊断的优缺点？如何弥补缺点？透射电镜优点是分辨能力高，可观察小于0.1um的细胞微细结构和各种特殊物质以及病原体由于其所观察切片厚度为100nm范围，视野小，观察范围局限是其最大缺点为了克服其缺点，通常采取三片会诊，即常规切片（光镜）、半薄切片、超薄切片（电镜）检查。总之电镜在临床病理诊断中必须以光镜为基础，结合半薄切片定位，才能最大性能的发挥其优势，避其缺点第二十二页，共27页。16免疫电镜技术免疫电镜技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。根据标记方法的不同，可以分为免疫铁蛋白技术，免疫酶标技术和免疫胶体金技术。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段第二十三页，共27页。17何谓分子影像学？简述小动物光学活体成像技术的分类及各自的优点概念：应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究分类：小动物分子光学活体成像技术分为生物发光成像法和荧光成像法优点：生物发光：①特异性强，无自发荧光；②灵敏度高；③可检测的深度较深，适合深层成像；④发光稳定、定量精确荧光发光：①荧光染料、蛋白标记能力强、种类多；②信号强度大；③实验成本低；④活体动物、动物尸体、离体器官、组织均可成像第二十四页，共27页。