健脾清热化瘀药对胃溃疡大鼠表皮生长因子及其受体表达的阻碍

健脾清热化瘀药对胃溃疡大鼠表皮生长因子及其受体表达的阻碍包永欣,吕冠华,赵金婷,李海泉【摘要】目的通过观看健脾清热化瘀药对血清和胃黏膜组织表皮生长因子(EGF)含量及其受体(EGFR)表达的阻碍,探讨不同中药治法对实验性胃溃疡愈合质量的阻碍及其作用机制。方式采纳冰乙酸注射法制备大鼠胃溃疡模型,随机分为模型组、雷尼替丁组(西药组)、健脾中药组(中药A组)、清热中药组(中药B组)、化瘀中药组(中药C组)和健脾清热化瘀中药组(中药D组),并设立正常对照组(空白组)。在光镜下观看溃疡指数(UI)、再生黏膜厚度及黏膜肌层缺损宽度,应用ELISA法检测血清及胃黏膜EGF含量,免疫组化法检测胃黏膜EGFR的表达。结果健脾、清热、化瘀中药及其合方都能使再生黏膜厚度增加,溃疡指数及黏膜肌层缺损宽度减少,与模型组比较不同有统计学意义(P＜,中药D组疗效明显优于西药组(P＜或P＜。中药各组及西药组血清及胃黏膜EGF含量较模型组及空白组明显升高(P＜,且可明显增强胃溃疡黏膜EGFR的表达(P＜或P＜,尤以中药D组疗效最为显著(P＜。结论健脾、清热、化瘀中药可通过增加EGF和EGFR水平,增进胃黏膜上皮细胞增生及组织黏膜修复,提高溃疡愈合质量。【关键词】健脾清热化瘀药；表皮生长因子；表皮生长因子受体；溃疡愈合质量；大鼠Abstract：ObjectiveTostudytheeffectandmechanismofinvigoratingspleen,clearingheatandeliminatingstasisdrugsonQOUHofgastricmucosaandexpressionofEGFandEGFRinratmodelofgastriculcer.MethodsTheratmodelofgastriculcerwasconstructedbyinjectionofaceticacid.Theratswererandomlydividedintomodelgroup,ranitidinegroup,invigoratingspleengroup,clearingheatgroup,eliminatingstasisgroup,complexprescriptiongroupandnormalcontrolgroup.Theulcerindex(UI),regeneratemucosalthickness,laminamuscularismucosalwidthwereobservedbyHE,andthelevelofEGFwasdetectedbyELISA.TheexpressionofEGFRinthemucosaaroundtheulcerwasdetectedbySABCkitimmunohistochemicalmethod.ResultsComparedwithmodelgroup,theregeneratemucosalthickness,laminamuscularismucosaedefectwidthandUIininvigoraingspleen,clearingheat,elimiantingstasisandcomplexprescriptiongroupsweredifferentsignificantly(P＜.Andtheeffectofcomplexprescriptiongroupwasbetterthanranitidinegroup(P＜,orP.Comparedwithmodelgroupandnormalcontrolgroup,thelevels ofEGFinserumandgastric mucosaintreating groupswereincreased

significantly

(P

＜.

Positive

expression

of

EGFRaroundulcerative tissues intreating groupswerestrengthenedobviously(P ＜,orP＜,andtheeffectofcomplexprescriptiongroup wasthe best (P＜. Conclusion Invigorating spleen,clearingheatandeliminatingstasisdrugscanincreasethelevelofEGFandEGFR,andpromotegastricmucosaepithelialhyperplasiaandtissuemucousrenovationandimproveQOUH.Keywords：invigorating spleen, eliminating stasis drugs；EGF；EGFR；QOUH；rat临床资料显示,胃溃疡的要紧病机为脾胃虚弱、 热毒内结、气滞血瘀。应用健脾清热化瘀中药不仅能排除溃疡病的损害因素,增强胃黏膜爱惜因素,而且在治愈溃疡病的同时,还能对紊乱的消化功能进行调整,提高溃疡的愈合质量,从而降低其复发率[1]。本研究通过检测胃溃疡大鼠血清及再生黏膜表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)表达的转变,探讨健脾清热化瘀中药提高溃疡愈合质量(QOUH)、减少溃疡复发的机制。实验材料动物清洁级SD雄性大鼠,体重200～220g,共70只,沈阳军区总医院实验动物中心提供,许可证号：SCXK-(军)2007-001。药物健脾中药：黄芪20g,党参15g,甘草5g；清热中药：蒲公英15g,紫花地丁15g,黄连5g,半枝莲15g；化瘀中药：当归10g,丹参15g,莪术15g,延胡索10g。上述药材单味药配方颗粒购自广东一方制药。雷尼替丁胶囊由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药生产,批号1059,150mg/粒。仪器与试剂EGF酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒由深圳晶美生物工程提供； EGFR多克隆抗体及即用型 SABC免疫组化试剂盒由北京中杉生物工程提供。图像分析采纳MPIAS多媒体彩色病理图纹分析系统。实验方式造模应用冰乙酸浆膜下注射法制备大鼠胃溃疡模型 [2], 造模前禁食不由水24h,2%速麻安2号注射液10mL/kg腹腔麻醉后,将大鼠固定,在上腹部皮肤正中切口,沿腹白线剪开腹壁组织,打开腹腔,以1mL注射器在胃窦前壁胃壁肌层与浆膜层之间注入 100%冰乙酸mL,然后覆盖网膜,中断缝合腹膜、腹壁各层组织和皮肤。分组及给药只大鼠随机分为7组,即空白组、模型组、雷尼替丁组(西药组)、健脾中药组(中药A组)、清热中药组(中药B组)、化瘀中药组(中药C组)和健脾清热化瘀中药组(中药D组),每组10只。空白组大鼠不做任何处置,其余6组造模3d后开始给药。医治组用药剂量按人与大鼠体表面积换算,200g大鼠别离给予mg的雷尼替丁、g的健脾中药、g的清热中药,g的化瘀中药、g的健脾清热化瘀中药,空白组与模型组给予%氯化钠溶液。各组均按2mL/200g大鼠体重的剂量灌胃,每日1次,共14d。标本搜集与处置实验终止后,将大鼠禁食24h后麻醉,于腹主动脉采血 4mL,在室温下静置后,2500r/min离心10min,取血清,-20 ℃保留备用。打开腹腔,别离结扎贲门、幽门后掏出胃,沿胃大弯剪开,冰生理盐水冲洗,在放大镜下用游标卡尺测量溃疡长径和短径,以溃疡瘢痕平行于胃长轴方向的最长径为中心取材,放入4%多聚甲醛中固定,24h后石蜡包埋切片。留取溃疡边缘组织约100mg,用mol/LPBS溶液制成10%的组织匀浆,离心后取上清液,-20℃保留以备检测EGF。观看指标与检测方式①溃疡指数(UI)：采纳游标卡尺(精准度mm)测量溃疡面的最大长径和垂直于最大长径的最大宽径,以二者的乘积作为溃疡指数。②再生黏膜厚度与黏膜肌层缺损宽度：参照杨氏方式 [3],在HE染色的切片上,用低倍镜(×10)找到溃疡部位,在高倍镜下(×40)用显微镜测微尺进行测量,观看5个视野,计算平均值。③血清与黏膜的 EGF含量：采纳ELISA方式检测,按试剂盒说明书步骤操作。④黏膜 EGFR蛋白表达：采纳免疫组织化学方式 ,严格按试剂盒说明书步骤操作。应用 MPIAS多媒体彩色病理图纹分析系统对每张切片随机选取 5个视野进行图像分析,即采纳积分光密度、面积百分比来观看 EGFR的表达。细胞膜或细胞浆显现棕黄色颗粒为 EGFR阳性细胞。 3统计学方式数据均以x±s表示。统计学分析采纳统计软件,各组数据之间比较应用方差分析。结果(见表1～表3)表1各组大鼠UI、再生黏膜厚度及黏膜肌层缺损宽度转变比较(略)注：与模型组比较,*P＜,**P＜；与西药组比较,#P＜,##P＜；与中药A组比较,▲P＜,▲▲P＜；与中药B组比较,△P＜；与中药C组比较,○P＜,○○P＜；与空白组比较,▽P＜,▽▽P＜(下同)表2各组大鼠血清及胃黏膜组织EGF含量转变比较(略)表3各组大鼠胃黏膜EGFR免疫组化图像分析结果比较(略)5讨论胃溃疡是临床常见病、多发病,中西医药物医治均能取得较好的近期疗效,但停药后易复发,因此,防治溃疡的复发成为医治胃溃疡的关键。消化性溃疡的愈合是一个超级复杂的进程,包括细胞移行、分化、增殖和细胞外基质形成及新生血管生成等。Taranwski等[4]指出溃疡的愈合和复发与QOUH有关,以为溃疡愈合不仅需要修复缺失的黏膜,更需要重建黏膜下的组织结构和功能。评判QOUH不仅要评判溃疡局部再生黏膜结组成熟度,更应重视其功能成熟度,并以此判定其对以后溃疡复发的阻碍及评判药物对溃疡的疗效。溃疡的愈合和愈合质量与胃黏膜EGF及其受体的表达紧密相关,EGF是一种在细胞增殖和分化中起重要作用的分子[5],具有抑制胃酸分泌,增加胃黏膜血流量,增加黏膜细胞的DNA、RNA及蛋白质的合成,增进胃黏膜上皮细胞增殖,又能增进表面上皮细胞透明质酸酶的合成、成纤维细胞生长和胶原产生的作用,从而有利于溃疡的愈合。Konturek等[6]实验证明,乙酸刺激产生的胃溃疡,其愈合进程伴有明显的EGF表达。EGF表达增强能够增进溃疡边缘增生,使分化的表皮细胞迁移至肉芽组织,覆盖溃疡面。而EGF要发挥作用,必需与相应的受体结合。EGFR对EGF有高度特异性和亲和力,普遍存在于多种上皮细胞膜上,具有增进胃肠黏膜增殖、发育及修复,减少胃酸分泌等重要功能。当EGF抵达靶细胞表面时,专门快与细胞膜上EGFR结合,诱导其产生某种变构,形成受体二聚体,激活受体膜内区域的酪氨酸蛋白激酶,使自身的一系列酪氨酸被磷酸化,调剂细胞生长与分化。Tarnawski等[7]观测发觉,当胃黏膜受损或溃疡形成后,损伤组织边缘黏膜EGF及受体表达增加,在二者的调控下,黏膜上皮成份发生转变,上皮细胞失去分化能力,发生增殖,移行到肉芽组织表面,从而覆盖溃疡底部,增进溃疡愈合。健脾清热化瘀中药医治胃溃疡是沈阳军区总医院王长洪主任医师连年临床实践总结出来的医治方药,临床疗效确切,具有减缓病症,明显减少复发的特点。方中蒲公英、紫花地丁、黄连、半枝莲清热以祛邪,黄芪、党参、甘草益气健脾扶正以治本,当归、丹参、莪术、延胡索活血止痛、去瘀生新,诸药合用共奏扶正祛邪,标本兼顾之效。本研究从治法与药物入手,探讨健脾清热化瘀中药对实验性胃溃疡愈合质量的阻碍,结果说明,健脾、清热、化瘀药物及其合方都能使再生黏膜厚度增加,UI及黏膜肌层缺损宽度减少,与模型组比较不同有统计学意义(P＜,中药合方医治组疗效明显优于雷尼替丁医治组(P＜或P＜,说明健脾、清热、化瘀中药有增进上皮组织再生和改善瘢痕修复能力,提高再生黏膜结组成熟度的作用。中药各组及雷尼替丁医治组血清及胃黏膜EGF含量较溃疡模型组及空白对照组明显升高(P＜,说明雷尼替丁与健脾清热化瘀药均能通过刺激EGF分泌,产生增进上皮增殖、保护组织修复和细胞爱惜的作用。本研究观看到EGFR存在于胃黏膜上皮细胞和黏膜肌细胞,健脾清热化瘀中药可明显增强胃溃疡边缘上皮细胞EGFR的表达(P＜,说明胃黏膜上皮细胞是EGF的靶细胞,EGFR是溃疡病组织修复进程中的要紧环节。因此咱们推测健脾清热化瘀中药提高QOUH的机制可能与激活EGF/EGFR系统、增进胃黏膜上皮细胞增生和组织修复有关。【参考文献】周福生,胡丽娟,黄绍刚,等.健脾清热化瘀方抗胃溃疡及复发临床疗效分析[J].北京中医药大学学报,2006,29(10)：717－720.王英.冰乙酸性大鼠胃溃疡模型制作方式比较[J].有效诊断与医治杂志,2007,21(7)：505－506.杨雪松,李益农,叶嗣懋,等.大鼠胃溃疡愈合质量与抗强的松再损伤关系的实验研究[J].北京医科大学学报,1996,28(6)：454－456.[4] Tarnawski

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