6 分子诊断的规范化及质量控制-张波

河南省肿瘤医院马杰数字PCR（dPCR）在精准医疗中的应用

河南省肿瘤医院马杰精准医疗“IhearsomuchabouttheNIH,andit’sterrible.”Trumpsaidthatscientificadvances“requirelong-terminvestment.”2023/3/25精准医疗InFuture???第一章第二章第三章数字PCR技术背景数字PCR在精准医疗领域中的应用数字PCR技术在精准医疗领域应用展望1992199719992003200620112013

1stPCR(1985)2edRT-PCR(1996)

3rdDigitalPCR(1999)4thPCR(???)DigitalPCR理论与技术的发展历程Digital

PCR初形提出Digital

PCR第一台芯片dPCRQuantStudio3D

纳升级芯片出现BEAMing技术微滴Digital

PCR

灵敏度高：检测下限低达0.04%；绝对定量：精确反映样本中基因突变片段的拷贝数；快捷无创：无需穿刺等侵入性活检，可外周血进行检测，安全，患者痛苦小报告周期短：操作简便，2-3天之内出检测结果

ZhuGSetal.,JMolDiagn,2015,17(3)DigitalPCR技术特点DigitalPCR技术原理一个反应上万个反应NanodropletPCRreactionsareindependent,singleamplificationevents油包水技术数万个液态partition固态分隔液态分隔以微滴数字PCR为例DigitalPCR工作流程DigitalPCR技术在精准医学中的应用稀有突变检测转基因成分检测病原微生物检测基因表达分析测序文库定量无创产前检查拷贝数变异分析DNA残留检测/CRMCs质控标定DigitalPCR在拷贝数变异的应用异常的拷贝数变化是许多人类疾病（如癌症、遗传性疾病、心血管疾病）的一种重要分子机子，作为疾病的一项生物标志，染色体水平的缺失、扩增等变化已成为许多疾病研究的热点。CNV（CopyNumberVariations，拷贝数变异）研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异DigitalPCR在拷贝数变异的应用利用qPCR方法，一般能准确区分CNV是1/2/3的情况，但仅此而已。5vs6的情况下，Ct值的理论差值为~0.25，7vs8的情况下，Ct值的理论差值为~0.15.对于精度要求更高的情况下(例如区分5/6CNV)，qPCR就非常困难。因为这种情况下Ct值的理论差值本来就非常小，PCR的扩增效率以及其他误差会对结果造成很大的影响TocallCNVcorrectly,itisadvisedtohaveatleast18–40replicates(Methods50(2010)pp271-276)Gonzalesetal.,2005.DigitalPCR在拷贝数变异的应用背景：哈佛医学院由StevenAMcCarroll领导的实验室对人17号染色体的17q21.31区域进行了深入研究，因为该区域复杂的基因组结构变异与神经性疾病以及妇女的不孕不育有关。

问题：首先他们采用NGS进行了全基因组测序，在上述区域内发现了很多包括CNV在内的基因组结构变异，他们将该区域分成了3个大的片段。这时他们需要一种成本可控，高通量且快速的实验方法来对NGS发现的CNV位点在大样本的情况下进行验证。结论：在文献中，他们采用了ddPCR的方法来完成对大样本的测试，结果显示ddPCR的结果与NGS的数据高度吻合，相关性大于99%。DigitalPCR在基因表达研究中的应用免疫组织化学技术—蛋白水平检测Immunohistochemistry,IHC荧光原位杂交技术—基因水平检测Fluorescentinsituhybridization,FISH由于Her-2融合断裂现象的存在，Fish检测Her-2基因扩增存在着假阴性的可能Fish无法检测非扩增的HER-2基因强烈表达，而经适当选择对照基因及引物探针的位置，仍可用于数字PCR上相比于FISH的大片段荧光探针不完全结合，数字PCR可更有特异性地对HER-2基因进行扩增检测。专为靶向药物治疗而设计的引物探针组合更能反映HER-2基因的拷贝数和表达量（包括了融合、断裂的HER-2基因免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)是肿瘤状态评估及病人预后的标准检测方法，但是检测成本高，费时费工，依赖实验人员的专业技能以HER2检测为例传统IHC与FISH检测HER2是一种相对主观，劳动密集型且判断模糊的一类检测ddPCR检测HER2可精确判断扩增量，是一种相对敏感，客观的检测方法敏感性:

87.5%特异性:

94.1%一致性:92%敏感性：37.5%特异性：75%一致性:62.5%Kinugasa

etal.,BritishJCancer.2015(112):1652–1655DigitalPCR在Her2表达研究中的应用

IHC/FISH检测HER2阳性和阴性的患者的生存率（SR）无明显差异；

ddPCR检测组织标本HER2阳性和阴性的患者的生存率（SR）无明显差异；采用ddPCR进行血液ctDNA检测HER2阳性的患者的生存率（SR）明显低于血液

ctDNA检测HER2阴性的患者Kinugasa

etal.,BritishJCancer.2015(112):1652–1655DigitalPCR在Her2表达研究中的应用敏感性:

76.8%特异性:

78.9%一致性:

77.3%74.7%

62.6%DigitalPCR在K-ras突变检测的应用HideakiKinugasa

etal.,Cancer.2015,2271-2280HideakiKinugasa

etal.,Cancer.2015,2271-2280超声内镜引导下的针吸标本中K-RAS突变与野生型的患者中位生存时间（MST）无明显区别（p=0.13）；血液标本中K-RAS突变型患者的中位生存时间（MST）短于野生型患者（p=0.02）。采用患者血液ctDNA可以高效检测患者K-RAS突变，且该突变与临床疗效密切相关。DigitalPCR在K-ras突变检测中的应用DigitalPCR在EGFR突变检测中的应用Fig.1入组研究患者流程图标本采集与处理：10-20mL外周血，EDTA抗凝管分离血浆，提取cfDNA

(with4hour)血浆ctDNA检测平台：BEAming数字PCR（Sysmex,Inostics)AFfor19exondel≥0.04%AFforL858R≥0.04%AFforT790M≥0.06%BEAmingDigitalPCRWorkflowOxnard,etal.JCO,2016,7.DigitalPCR在EGFR突变检测中的应用Plasma(BEAming)Tumor(ARMS)Exon19del+Exon19del-Exon19del+112(82.3%)2Exon19del-2478(97.5%)L858R+L858R-L858R+63(86.3%)5L858R-10138(96.5%)T790M+T790M-T790M+111(70.3%)18T790M-4740(69.0%)T790M发生更加倾向于血浆携带敏感突变的患者人群（80.3%

vs

4.8%,P<0.01），鉴于两者之间相关性，后期耐药血检应联合敏感突变和T790M检测Fig.2血液检测敏感性分析Oxnard,etal.JCO,2016,7.DigitalPCR在EGFR突变检测中的应用Fig.3血液检测特异性分析以组织作为“金标准”，血检T790M特异性仅为69%，18例患者出现血液(+)组织(-)，判断这些患者是否为方法学假阳性or组织学异质性？ddPCR

or

Cobas

platform

for

18

discordants其中14例T790M阳性再次得到验证，揭示耐药肿瘤异质性Oxnard,etal.JCO,2016,7.DigitalPCR在基因突变动态监测中的应用不同患者在不同治疗时间段、不同转移部位，不同标本来源中基因突变状态与患者治疗之间存在联系，且随着时间和空间变化发生着变化。L858RT790MGeoffreyetal.,ClinCancerRes.2014.20(6):1689-1705ZhijieWetal.,Plosone.2014.11(9):e110780DigitalPCR在肺癌预后中的临床应用中位PFS(月)中位OS(月)

血浆EGFR

阴性6.723.8血浆EGFR阳性（低丰度0-5%）11.129.3血浆EGFR阳性（高丰度>5%）15.444.5中位PFS(月)中位OS(月)P值

T790M突变含量下降12.728.30.001T790M突变含量增加7.114.90.027DigitalPCR在未来血液检测中意义非凡T790M耐药活检之前，先利用ddPCR对于血浆T790M快速筛查A.传统模式EGFR-TKI耐药发生病人进行二次组织活检，来检测是否有T790M突变Thirdgen.EGFR-TKIT790M

positiveT790M

negativeChemotherapyB.当前模式EGFR-TKI耐药发生以政府批准的血检方法和检测平台

，先为耐药病人进行T790M&敏感性突变的检测T790M

negativeT790M

positive跳过二次活检,开始第三代EGFR-TKI治疗进行二次活检，再次确认是否有T790M突变存在T790M

positiveT790M

negativeThirdgen.EGFR-TKIChemotherapy在T790M耐药检测过程，组织标本仍为“金标准”，血液标本将由补充变为初筛，发挥更加重要的作用；Oxnard,etal.2016ELCC.Abstract1350_PR.组织EGFR检测或者选择肺癌八基因进一步寻找治疗靶点发现AZD9291获得性耐药机制--C797S突变ThressKSetal,NatMed.2015Jun;21在T790M基础上出现C797S的模式有两种cis：两个突变在同一个等位基因上trans：两个突变不在同一个等位基因第三代EGFR-TKI耐药C797S位置不同引起疗效差异在对细胞系的研究发现，C797S与T790M之间transorcis排列，对药物的响应不同NiederstMJetal,ClinCancerRes.2015DigitalPCR对不同DNA联接方式检测DigitalPCR与NGS平台的联合利用探索本研究探索EGFR

T790M检测流程优化（ddPCR+NGS）DigitalPCR与NGS平台的联合利用探索针对具有重要临床意义的驱动基因提出一种“快捷，经济，节约”的全新检测途径突变比例分析BorsuL,etal.JmolDiag.2016(18):902-911总结应用展望ddPCR是一种绝对定量，灵敏度较高的新一代基因检测方法；目前由2016ELCC

abstract资料显示，血检可以当成T790M预筛方法，ddPCR具有决定性优势；针对第三代TKI耐药突变C797S与T790M顺反式排列，ddPCR技术优势明显；探索ddPCR与NGS等平台综合利用，挖掘最快捷，经济，全面的驱动基因检测流程；ddPCR可实现对CNV，HER2扩增表达，EGFR点突变等高灵敏度检测；ddPCR可以动态监测肿瘤患者治疗过程中基因突变状态，为临床治疗提供前瞻建议；ddPCR可绝对定量已知突变基因丰度来预测治疗疗效，帮助临床合理制定治疗方案；背景河南省肿瘤医院ddPCR平台数据分析T790M人数(%)TKI治疗后PD(%)SD/PR+12(35.3)12(46.1)0-22(64.7)14(53.9)8合计34(100)26(100)8接受TKI治疗人数(%)T790M+

(%)

-+34(41.5)12(35.3)22-