基因操作习题和答案

第一章一名解：Gene基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。启动子。分可以与RNA聚酶特异结合的部，也就是使转录开始的部位。Subcloning亚克隆。当初始克隆中的外源DNA片段较，含有许多目的基因以外的DNA片时，在诸如表达、序分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段找来，这个过叫“亚克隆二填题基操作）核心部分是基因克隆genecloningcloning的本要点有（和（参考答案：克基因的类型；受体的选择；载体的选择（）是遗传物质的基本单也是作为遗传物质的酸分子上的一段片段。它可以是连续的，也可以是（以是（可是RNA可以存在于染色体上，也可以（参考答案：基；不连续的；存在于染色体之外（如质粒，噬菌体等）基操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的（因研究相关的内容。参考答案：表达调；检测；改造启子）是指（一个Gene是表达是关键的一步，是起决定作用的在转录过程中，Promoter是（）的结合位点。参考答案：基转录过程中控制起始的部位；转录起始RNA聚酶原生物的RNA主由两部分组成和中-因子并不参与RNA的成，它的作用主要是（核心；因；识别要转录的起始位点从）到（）的这一段距离称为一个转录单位，或者一个转录产物，其中可包括一个或者多个。启动区；终止区转终止子主要有两种，一种是（一种是（依赖ρ因子；不依赖ρ因的写方式，通常是写出的DNA序列总是与（）相同的那条链是（到（基的位置，一般自转录起始点向两个方向编号，其中转录起始点定为（-1。参考答案：mRNA；；；+1；起始点上游第一个碱基重基因gene）指（隔因Interrupted）是指（）参答案：一基因的序列中，单个序可编码个以上的蛋白质；在编码序列中间插入的一段无编码作用的碱基列三简题1.简基克隆两基特？参考答案：基因隆的两个基特征是一是强调外源核酸分子（一般情况下都是）不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征因作的另一个重要特征是繁殖。谈你对的识，并简要说说概念的发展情况？※如何解及产的线性非线？参考答案：基决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。在原核生物中，基因及其产物是共性的。年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就后来所说的基因间存在着内含子。内含子指真核生物基因中不能被翻译成蛋白质的片，但可被转录，当两侧序列的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。外显子是指够翻译成蛋白质的任一间

断的基因片段，一个基因可有多个外显子。内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一个DNA片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可以作为外显子。什么genecloning？么亚隆）参考答案：基克隆：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，经过酶切消化等步骤，分离带有目的基因的片段。基因亚克隆：初步克隆中的外源片段往往较，含有许多目的基因片段以外的片，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的小段找来，这个过程叫“亚克隆假从一个原核生物中cloning某因（1-2kb谈谈它的基本步骤？参考答案：①原核生物染色体进不完全酶切，纯化所得到的片，并与载体连接，转化大肠杆菌；②得到转化子后，根据目标基因两侧的已知序列设计探针，杂交，筛选转化子；③所得的转化子中含有目标基因，进一步作亚克隆，一步步地向目标基因逼近，最后可得到目标基因什叫基因工程从理论和技术两个方面谈谈Engineering诞生的基础参考答案：基工程）又称基因操作Manipulation组。因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因分子预设计的蓝图，在体外构建杂种分子，然后导入活细胞，以改变生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。思考题问题：简基因操作、因重组和基因工程的关系。思考题问题：为么说基因工是生物学和遗传学发展的必然产物？思考题问题：简基因的结构成对基因操作的影响。第二章一名解1.Restrictionandmodification限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质DNA）的现象称为限制。外源遗传物通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。ends匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称匹配粘端，亦即粘性末端（Blunt平末端。在回文对称轴上同时切割DNA的条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。Isoschizomer：同酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。：同尾酶。来源不同、识别序列不同，但生相同粘性末端酶。6.Sitepreferences：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。7.Staractivity星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。切酶。有限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。fragmentKlenow片段KlenowDNA聚酶是polymerase经蛋白（枯草杆菌蛋白酶裂解而从全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影响。测序酶。是改造的T7噬体DNA聚酶，切除了以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切了所有的外活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。11.Reverse反转录酶依赖于的DNA聚合酶5'--3'合活无3'--5'外活性来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或（鼠血病病毒，又称M-MuLV12.

末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻的聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化加于分的3'羟端。若dNTP为或，二价阳离子首选钴离子；若dNTP为A或，二价阳离子首选离子。13.Ligase连接酶。催化5'磷基与3'羟之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。14.T4多核苷酸激酶。催化ATP的磷酸基转移至或RNA的5'末。15.Alkalinephosphatase碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠（Calfintestinal称或CIAP，也有来自细菌（BAP化除去或RNA磷酸。16.S1核酸酶。来源于曲霉Aspergillusoryzae降单链或RNA，生带5'磷的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA，dsRNA，杂体敏感。17.Щ外切核酸酶。源于大肠杆菌，催化从dsDNA逐去除单核苷酸的反应，底物为或线状和带切口或缺口的环状，反应结果是在上产生长的单链区。18.Singlebinding单链结合蛋白。此蛋白能协同地与ssDNA结合而不与结合，可以削弱链内二级结构的稳定，从而加速互补多核苷酸的重新退火并通过消除阻碍聚酶前进的链内二级结构而提高这些聚合酶的持续作用能力。19.K蛋酶K是有高活性的丝氨酸蛋白酶枯草杆菌蛋白酶可以水解范围广泛的肽尤适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键。K指蛋白酶通过水解角蛋白（keratin可以为该霉菌提供所有所需的碳源和氮源。20.Lysozymes溶酶。一类水解细菌细胞壁肽聚糖的酶，常用的是卵清溶菌酶，用于破碎细胞。二填题1.Ecok的般分子组成为，这些亚基中，亚基具有（）的作用，M亚基具有（）的作用，亚基具有（）的作用，当该该酶发生作用时，需用到的辅因子有；甲基化识别序列；ATP；SAM限性内切核酸（Restrictionendonuclease的名是按属名和种相结合的原则的常第一个大写字母取自（二三个字母取自（个字母则用（）表示。参考答案：属的第一个字母；种名的前两个字母；菌株名Ⅱ型限酶识别回文对称序列，在回文序列（）或（）切割，生带3'－OH和－P基团的的产物，需（）的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需。参考答案：内；附近；Mg2＋从特网上可以找到限制酶的数据库（网由NewEngland公维护（REBASE识相同序列的限制酶称（）同酶Ⅰ-CeuI酶衣滴虫叶绿体大rRNA基的内含子编码的产物，识别位点为（），识别的核心部为（）至（）位置的，应温度为37。；-12；位偏爱是指限制酶对不同位置的同一个识别序列现出不同的切割效率单Ⅰ或NarⅠ的定义参考答案：切1g腺毒在体中小时所需的酶量有限制酶只切割双链中一条链，产生单链缺口，即（）切酶10.个间限性片段度的差异叫（）限性片段长度多态性）11.载经Hind切割产生粘性末端，能发生载体自连响体与外源的接效率，常用的防止载体自连的方法有（磷酸化；部分补平12.完的文序列应具备两个特点即（）和（参考答案：能在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；两条互补链的5'--3'的列组成相同，即将一条链旋转°，则两条链重叠13.DcmMethylase（Dcm甲化酶）的识别序列为（）和（的用位点（CCTGGCCAGG第二个胞嘧啶的位置

填空题问题：大肠杆菌中至少三种依赖于甲基化的限制系统（各相同，但只识别经过甲基化的序列，都限制CpG甲基化酶作用的。mcrA；mcrBC14.分写以下限制性内切核酸Restrictionendonuclease的识别序列（Hind（GAATTC；；AAGCTT15.单的定义为（）参考答案：在37下分内催化从焦磷酸根置换到[γβ所的酶量16.限性切核酸酶Restriction）常保存在（）浓度的甘油溶液中。17.载和源经酶切，在进行下一步操作前，需消除限制性内切酸酶（）影响。常用的方法有（参考答案：法；加热法；苯酚抽提法；试剂盒酶法18.对进行双酶切时，酶切缓冲液的选择原则(1)（（（参考答案：可选都合适的缓液或通用缓冲液；若缓冲液不可替代则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液19.Ⅰ内切核酸酶，在不同的辅因子条件下，产生不同的酶切效果，当Mg2+存时Mn2+存在时（参考答案：独立作用于每条链且切割位点随机；可在两条链的大致同一位置切割，产生平端或1到个甘酸突的片断20.聚酶是E.coliDNApolymerase经白酶裂解而从全酶中除去（）活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。5'--3'的切活性polymerase分量（，该酶的的切活性比酶强（）倍，由于它不从单链模上替换引物，故可用于（；；提高诱变反应21.反录来自AMV或MoMLV即赖于的DNA聚酶它（活性但（活。合成的3'--5'的切22.末转酶来源于（存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞的一种不寻常的聚酶，在（）存在下，末端转移酶催化dNTP加DNA分子的3'羟基端。小牛胸腺；Mg223.T4连酶的分子量为68kDa，可以催化DNA磷基与3'羟之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的RNA或。浓度（）和（）可以提高平端连接效率。聚二醇PEG单阳离子24.E.coliDNA连接酶与T4连接酶相似，但需（）的参与，且其平端连接效率常用于置换合成法。烟酰胺－腺嘌呤二核苷酸（＋多苷酸激酶在高浓度的时挥最佳活性是强烈抑制剂NH425.核酸酶主要活性为3'外切核酸酶活性，可从线性两链的端去除掉单核苷酸；还可从内部切割核酸，作用于单链。BAL31发作用依赖（制活性。＋EGTA26.绿核酶来源于绿豆芽，与S1酶相似，但比酶温和，在（）上才切割，可使突出端变成平端。大切27.核核酶A来于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击（DNA:RNA中杂交的RNA区，可用来确定或中碱基突变的位置。RNA上啶残基的3'端28.用构嵌套缺失体常用到的核酸酶有（Ⅰ外切核酸酶Ⅲ29.琼糖作用于低熔点琼脂糖活性是可切割琼脂糖酶亚单位于酶可分解琼脂糖应用分离大片段三择题限性内切酶一般保存在（）浓度的甘油溶液中。50%点评：合适浓度的甘油和二甲基亚砜可以作为冰冻保护剂，保护生物大分子的活性。限性图谱与限制性片段长度多态性RFLP）图谱的最显著区别在于（）参考答案：A前者是物理图谱后者是连锁图点评：详细理解两者的概念迄为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（）只作用于双链

点评：限制性内切核酸酶的识别和切割序列有很强的特异性，特别是第Ⅱ型限制性内切酶。已某一内切酶在一个环状上个点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到）个片段点评：注意分的形状，其它条件相同的时候，线状比环状产生的片段要多一个。甘会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变导一些酶星星活性的主要原因之一止办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（）以下A点评：低温下保存生物大分子时，甘油可以作为冰冻保护剂，但反应体系中甘油浓度过高会导星星活性。在列进行部分酶切的条件中，制哪一项最好（）酶量点评各种酶都有适合自己的反温度时根据酶反应动力学切反应一定时间后酶的活性就减弱或丧失，所以控制酶量是最合适的下试剂中，哪一种可以螯合Ca2＋离子（）EGTA点评：EDTA螯合等金属离子，EGTA螯合＋离子。被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有扩散，下列原因中，哪一项不太可能（）酶失活点评：理解限制性内切酶酶切本质和电实验原理。nick与的别在于（）A前是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失10.可在口部位起作用的酶是（）B核酶点评：BAL31核酶要活性为3'外核酸酶活性，可以从线性两链的端去掉单核苷酸；核酸酶可降解单链或RNA，生带5'磷的单核苷酸或寡核苷酸，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链糖核酸酶A可以特异攻击RNA上的嘧啶残基的3'端除去中未杂交的RNA区外切核酸酶可以作用于，续逐一释放’单核苷酸。11.酶与聚合酶相比，前者丧了（）活性参考答案：A外切酶点评KlenowDNA聚酶是E.colipolymerase经蛋白枯草杆菌蛋白酶解而从全酶中除去外切活性的多肽大片段，而聚合活性和外活性不受影响。12.限酶命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主株或生物型。命名（）参考答案：A属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号罗马字）点评：限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主株或生物型。命名时，依次取属名一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（）A识相同序列的限制酶称同裂酶点评：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为：同裂同切、同序异切酶、“同功多位”等13.下聚酶中，哪一种酶只切割双链中的一条链，产生单链切口，即切口（）AⅠ点评：在存下，独立作用于每条DNA链且切割位点随机。在存在下，它可在两条链的大致同一位置切割，产生平端或12个苷酸突出的片；Klenow聚酶是E.coli经蛋白枯杆菌蛋白酶解从全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段聚活性和3'--5'外切活性不受影响；T4噬体聚酶与KlenowDNA聚合酶相似但3'--5'外活性强倍且不从单链模上替换引物；噬菌体聚酶的活性功能与T4噬菌体聚酶和Klenow聚酶类似，但3'--5'外切活性为的1000倍。14.BAP与的别在于（）BCIAP68℃时活，而BAP℃稳定点评CIAP来源于牛小肠碱性磷酸酶BAP来自细菌的碱性磷酸酶BAP抗强温和去除污剂。可用蛋白酶K消化灭活，或在EDTA下℃或℃处理分，然后用酚、氯仿抽提，纯化去磷酸化的，而除去CIAP的活性。15.下哪种酶作用时需要引物（）B反录酶点评：其它三种酶均只需要链可16.CIAP催脱磷酸时有两种最适温度，37℃和℃，二温度分别适用于）端脱磷酸A突端；平末端和突出的3'端点评：端突出时，磷酸基团是内陷的，需要激烈一点的反应条件。17.关宿控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（）不恰当

参考答案：D这一系统的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶点评：根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分四类：Ⅱ型、Ⅱs型Ⅰ型、Ⅲ型18.限性切核酸酶可以特异性地识别（）C双DNA的特定碱基序列点评：了解限制性内切酶的识别序列。19.以为尾酶的是（）BBamHⅠ,Sau3A,Sty点评：所谓同尾酶即他们可以产生相同的粘性突出末端。其中B选中BamHⅠ识位点为G↓，Sau3AⅠ识位点为GATC，Ⅰ识位为CCWWGG）在长模板链的指导下引物延伸合成长的互链时应选用（）B聚酶点评：T7聚酶是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个20.在肠菌中大数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶以下选项中哪一种酶不包括在）Ⅰ点评：Ⅰ甲基化酶来自原核生物Spiroplasma21.在肠菌中，至少有种依赖于甲基化限制系统，以下选项中不属于这3种为（）点评：无22.以几核酸酶中，不能用于嵌套缺失的为（）核酶点评：S1核酸酶可降解单链或RNA，浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。23.下有限制酶的叙述哪个是错误的（）A限酶是外切酶而不是内酶点评：了解限制性内切酶的特性。24.在列中，催化反应不需要ATP的是（）DBamHⅠ点评：Ⅰ型和Ⅲ型限制性内酶在发生限制作用时需要，Ⅱ型不需要而BamH型限制性内切酶，在催化反应时不需要ATP25.连酶在体内的主要作用是在复修中闭缺口下对连接酶的描述中项是正确的（）参考答案：A将双链分中的5'磷基团同－OH末重新形成磷二酯键点评：了解连酶的特性。26.下酶，除（）外都具有磷酸酶的活性ABamHⅠ点评：磷酸酶活性包括磷酸化活性和去磷酸化活性。四简题1.简限性内核酶endonuclease）概及生学能参考答案：定：指识别的异序列，并识别位点或其周围切割双链的类内切酶。生物学功能：保护宿主不受外来分的感染，可降解外来的分，从而止其复制和整合到细胞中。引设引酶切点，什需酶位后上些基参考答案：限酶切割时对识别序列两端的非识别序列有长度要求就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸则限制酶难以发挥切割活性般需在设计引物时在限制酶切位点另加～4个碱基。试答影响限制性内切核酸酶Restrictionendonuclease）割效率的因素？参考答案：外：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏性；甲基化；底物的构象。在酶缓液，般加入，请加的作是么并述原？参考答案：作用提供一定的白质浓度保护限制性内切酶的作用制内切酶在稀释液会迅速变性，BSA是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白。何谓activity简述Staractivity的影响因及服法参考答案：在端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星活性。引起星星活性的的因素：①高甘油浓度酶过量>100U/ml低子强度<25mM高pH(>8.0)；

⑤有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide二甲基甲酰胺（dimethylformamide）等⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+或代Mg2+。星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有溶剂或乙醇；③提高离子强度到～150mM（不抑制酶活性的前提降反应pH至；使用Mg2+作二价阳离子。某DNA列存酶切位，此DNA为板在外成DNA列当该进酶时，发切不，分可原？参考答案：生物体内的序可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化的限制酶来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割情况。天然质载（plasmid）常需改后能用包去不要片，入克位点。试在过中何减切点参考答案：在酶切水平上，通酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点②同尾末端的连同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时产生新的酶切位，同时原来的酶切位点却消失；③平末端的连接双脱终法定DNA序列的片一不太，何用章学识定长片的DNA序列？参考答案：①将所需要测序的片采用2种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的序列；②用一种制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与载体连接后，测序，拼接，即可得到全长片。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的片断。大肠菌聚合Ⅰ具3'--5’外活和5'--3'的聚酶性及5'--3'的外活，根此推该合可具哪用?参考答案：①利用E.coli聚合酶的5'--3'外切核酸酶活性用切口平移法标记DNA所聚合酶中只有此酶有此反应；②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的聚合活性；③对3'突端的作末端标记（交换或置换反应10.用T4DNA可进末标，简其理参考答案：聚酶具有外切活性和的合酶活性，3'--5'的切活性可以被5'--3'的聚合活性所封闭，首先在反应体系中加入一种，生凹端，然后加入经过标记的dNTP，利用T4phageDNA聚酶的聚合活性补平3'凹，即可得到标记了末端的DNA片断。11.BAP和有何用为一采而不采用BAP？参考答案：作催除去或RNA5'磷酸抗性强抗温和去污剂。可蛋白酶K消化灭活，或在5mMEDTA下65处理或75处理分，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA，从而去除CIAP的活性。相比之下，CIAP比BAP更去除，此，一般采用。12.依赖的RNA聚合包噬体RNA聚合和T4或T7噬菌体RNA聚酶类合酶用表外基，述用构策？参考答案：①T7RNA聚酶基因置于E.colilacUV5启子之下，插入到λ噬体中，染E.coli，建立稳定的溶源菌。E.coliBL21（株即为将lacUV5启子和聚酶因置于λ噬菌体DE3区，该噬体DNA整于染色体的BL21处若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿菌中在IPTG诱下启外源基的表达先导入带噬体启动子控的目的基因的质粒用λ噬菌体（带T7RNA聚合酶基因）感染E.coli，活的基因的表达。13.简述T4多核酸酶活和途？参考答案：多苷酸激酶的性催化的γ－酸基转移到或RNA的末。可表现为两种反应，正反应指的γ－磷酸基被转移到去磷酸化的5'端用于对缺乏－磷酸的进行磷酸化。在交换反应中，过量的可该激酶将磷酸化的5'端磷酸转移给，后从γ－】ATP中得放射性标记的γ－酸而重新磷酸化，因此可用于DNA的末端标记。用途：该酶主要用于对缺－酸的或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通交换反应，用于标记5'末，以供－Gilbert法测序、核酸酶分析以及其它须使用末端标的骤。思考题问题：限性内切酶可分为哪几个类型，各自有何特点？

思考题问题：哪酶可用于片的末端标记？思考题问题：聚酶有哪些类型，各有什么性？思考题问题：在子克隆中所的酶主要作用于哪些底物？第三章一名解Vehicle载。将外或因携带入宿主细胞）的工具称为载体。具备以下三个必元件：复制原点、多克隆位点和筛选标记。Geneclone基克隆克作动词时指单一祖先产生同一的分群体或细胞群体的过程名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的分细或个体组成的特殊的生命群体用重组技分离目的基因，称之为基因克隆。Genelibrary基文库。由大量的含有基因组（某一生物的全部顺序）的不同片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。incompatibility质粒不相容性。利用同一复制系统的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及限系统时出现的现。α-complementationα-互。指基上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的α半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现的互补这两个无酶学活性产物混合在一起时恢复-乳糖苷酶的活性。X-gal/IPTG两都是乳糖的衍生物：乳糖操纵子底物，可以作为生色剂，被α半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落呈现兰色IPTG：乳糖操纵子诱导物。lyticgrowth裂生长状态。噬菌体侵染宿主细胞后，大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解的现象称裂解生长状态。state溶状态。噬菌体侵染宿主细胞后，将噬体基因组通过位点专一性重组整合到宿主的染色体中并随宿主的繁殖传给子代细胞的现象称溶源状态。Multiplicityof感复数。指单个宿主细胞感染的噬菌体颗粒数，等于实所用的噬菌体与细胞的数量之比。10.Insertionvectors插型载体。通过特定的酶切位点允许外源片插入的载体称为插入型载体。11.vectors置换型载体。而允许外源DNA片段替换载体的非必须DNA片段的载体，称为置换型载体。粘粒。带有将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的cos序列的质粒。包括质粒复制起点，可以象质粒一样转化并增殖；包括位点，可以象噬菌体颗粒一样包装、侵染。13.ReplicativeformDNA复制型。宿主细胞内，感染性的单链噬菌体（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链，用于DNA的复制，这种双链称复制型。14.Phagemid噬粒。具有复起点及单拷贝的丝状体噬菌体主要基因间隔区的质粒载体。此基因间隔区含病毒合的起始终止及噬菌体颗粒形态发生所必须的全部顺式作用序列的菌被噬菌体感染后，基因Ⅱ蛋作用于间隔区，启动滚环复制产生并进行包装。15.helpphageM13KO7辅噬菌体。M13单链丝状噬菌体的衍生株，基因Ⅱ带有个G--T的变。M13KO7基组链可达生子代单链所需的所蛋白。中变的基产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUCll8和pUCll9中病毒复制起点的作用有效，可以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链能占据优势。16.Yeastartificialchromosomes酵人工染色体载体。利用酿酒酵母）色体的复制元件来驱动外源片复制的载体称为酵母人工染色体载体。由自主复制序列、着丝粒、复制子及选择标记等元件组成。17.Bacterialartificialchromosomes细人工染色体。是基于大肠杆菌的F质构建的高通量低拷贝质粒载体。包括严谨型控制的复制区oriS、动复制的由驱的旋酶（，以及三个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因(和等件18.P1artificialchromosomesP1人染色体载体。结合了载体和BAC载体的特性是P1噬菌体载体

的改进载体。重组分子不能通过体外包装来感染宿主细胞，而只能通过电转化来将重组分子导宿主细胞。19.穿载体。能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的体称为穿梭载体。二填题载体（Vehicle的类型有（参考答案：质载体；噬菌体载体；粘粒载体；噬菌粒载体2.Gene是（因文库library是指（参考答案：利重组技分离目的基因；由大量的含有因（即某一生物的全部顺）不同段的克隆所构成的群体Plasmid的义是（能进行自我复制大数为（链（）状分，大小一般为（。染色体外的遗传因子；双；闭环1（）即为质粒的拷贝数，按照质粒拷贝数的多少，质粒可以分为（）和（是一些具有转移能力的大质粒质粒多数是一些具有转移能力的小质粒。参考答案：单细胞中所含有的质粒分子数目；严谨型；松弛型；严谨型；松弛型填空题松弛型质粒和严谨型质粒融合以后，杂合质粒一般优先使用（）的复制子。松弛型（称之为质粒的不相容性。如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则它们属于（同不同）的不相容群。参考答案：两质粒在同一宿主中不能共存的现象；相同质具有转移性，它是指（需要（）参考答案：在自条件下，很质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内；移动基因mob；移基因tra；移起始位点根质粒的转移性可以将质粒分为（）和（般大质粒是（都小质粒，其上没有（）参考答案：接型质粒；非接合型质粒；接合型质粒；非接合型质粒；编码其转的基因按用途可将标记基因分为选择标记和筛选标记标记一般用一般用鉴目的（载体）的存在；将特殊表型的重组子挑选出来常的用来鉴定重组质粒的细菌菌落的方法有（参考答案：－互补；插入失活；原位杂交10.质是基因工程最重要的人工粒之一的大小约kb于组建的三个亲本质粒（和（质具有一个colE1松型质粒制子，两个筛选标记氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，其colE1松型质粒复制子来源于（苄霉素抗性基因来源于（环抗性基因来源于（）参考答案：；pM131；pSC101pSF2124；pM131；pSF2124；11.系列的粒载体是由（）和（）两种质粒构建而来的，其中氨苄青霉素抗基因来自于位点来于（系列的质粒载体一般是成对存在的如和pUC19，主要区别是（参考答案：pBR322；M13mp18/19；；；MCS方不同12.质载的附加功能要素主要有（参考答案：－互补ssDNAorigin，promotor13.λ噬体Genome的长度约为（kb，其分子为（单双）链。它的分既可以以（）状存在也可以以环状存在，而且可以自然成环，其原因是在λ噬体的线性分子的两端各有一个长度为（）个碱基的天然粘性末端，这种粘性末端可以自然成环，成环后的粘性末端就叫做（参考答案：50双；线；；cos位14.λ噬体在感染大肠杆菌以后进Lyticgrowth也可以进入果其因组通过专一性重组整合到宿主染色体中，则其进入（它也可以选择进入（大量复制并组装子噬菌体颗粒。Lysogenicstate；Lytic15.在λ噬体载体中，常用的选择标记有（Ⅰ因失活和（）等。参考答案：LacZ；筛选16.改后λ噬菌体才可用作载体，按照改造方式的不同将其分为两种类型，即插入型载体（insertionvectors）和替代型载中Insertion是指（Replacementvectors是（）参考答案：通过特定的酶切位点许外源片插入的载体外片替换载体的非必须

片断的载体17.λ是个由噬体衍生而来的vectors，主要用于（缺失了含有溶源整合的（λ载体也是一种insertionvectors，载的最大特点是在最左侧可替代区置换了一段（）基因，可编码β-半乳糖苷酶，在平上可形成（）色噬菌斑。参考答案：克小的cDNA；b257lacZ；蓝18.λ噬菌体由于受到包装的限制，插入外源片段后，其总的长度应该在噬菌体genome的（）范围内。78%105%Cosmid实上是由（）和（）构成的杂合载体，也可以说是带有（）序列的质粒。cos位点；质粒；cos20.染体查指（采用段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。Cosmid的成包括三个部分中制子来源于（序列来源于（质复制起点；cos位点；抗性标记；质粒；噬菌体22.λ噬体的最大克隆片段是（）kb的最大克隆片段可达到（kb。；4523.利λ噬菌体载体构建的library中文是（形式存在的用粒载体构建的gene是以（）的形式存在的；粘粒载体构建的genelibrary是以（）的形式存在的。噬斑；菌落；菌落24.M13噬菌体颗粒是（）状的，基因组为（单或双）链。它只感染（）性大肠杆菌，感染宿主以后，其噬菌体颗粒的释放不像λ噬菌体那样要裂解宿主菌，而是（丝；；雄；从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒25.M13噬菌体仅有两个大的基因间隔区，分别位于（）与（）之间及（）和（）之间，这些基因间隔区内含有（）的元件。其中称为IG区它有三最重要的功能即（参考答案：ⅧⅢ；Ⅱ；Ⅳ；调节基因表达和合；GeneⅡ和Gene之间的间隔区；含有可对包装及DNA在毒颗粒中的定向进行调控的顺作用因子；正链与负链合起始和终止位点；不依赖与因子的转录终止信号26.RFDNA是（参考答案：复型，染性的单链噬菌体（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链，于的制。27.辅噬菌体是（）的衍生，它带有一个来自（）的复制起点，还带有一个来自（）的卡霉素抗性基因，用作选择标记；基因Ⅱ带一个（）的突变，导致基因蛋白质第位基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。参考答案：phage；；；28.载体基本组成元件有（参考答案：复起点；着丝粒；端粒；筛选标记29.表载vector是在常规载体的基础上衍生而来的，其构建的原理主要是增加一个（利于表达产物的分泌、分离或纯化的元件；穿梭载体Shuttlevector是指（）表元件；能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体三选题氨苄青素的工作原理为（）A可以抑制细胞壁肽聚糖的合成点评：、为环素的工作原理；C为氯霉素的工作原理与pUC19的别于（）B二的多克隆位点方向相反点评：系列载体的区别一般不大，主要是克隆方向或读码框等方面的差别。载所具备的特点中，以下描述不恰当的是（）参考答案：D必须具有较高的拷贝数，便于制备点评：对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝的质粒载体复制子三部分组成，以下不属于的为（）D启子点评：了解质粒的生物学性质。pBluescriptM13载体在多克隆位点的两侧引入了和两个噬菌体的启动子这样增加了该载体的功能，以下种能哪一种是不正确的（）

参考答案：D利用这两个启动子进行定点突变点评：了解M13载的工作原理及特性。以粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会出现大小不一、生长速度不一的现象，其原因是（重组体中插入片段的大小不同点评：插入片段本身的复制以及插入片段在宿主菌中的表达产物都会影响宿主的生长。噬粒是由质粒和噬菌体共构的其中来自质粒的主要结构（自菌体的主要结构）AA重组体中插入片段的大小不同点评：了解噬菌粒的生物学特性。野型的M13有10个因分为三个功能基团中与复制有关的两个基因）A基因Ⅱ基Ⅳ点评：熟悉噬菌体的遗传学性质。单链噬菌体的复制分为三个阶段，以下哪一项不属此（）DSS点评：RFDNA特指M13单噬菌体复制型双链10.λ噬体DNA和M13单链噬菌体在成熟前的复类型为（）A滚复制模型点评：λ噬菌体和M13单噬菌体侵染主后，都是先θ复模型，后转为滚环复制模型。11.以对pUC18的述中误的（）可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA点评没有IG区，不可能形成单链。12.以对粒为载体的重组体的描述正确的是（）B各组体在平板上生长的速度不同转化子中插入段的扩增量也是不同的点评理解粘粒载体的工作原理。13.下哪克隆载体对外源的载最大（）B酵人工染色体点评：人工染色体包括、、等其特点是可以装载大的100kb以）外源片段。14.同种粒，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是（）参考答案：BDNA>OCDNA点评：DNA分结构越紧凑，泳动时到的阻力越小，迁移速率越大。15.关穿质粒载体，下面哪一种说法最正确（）参考答案：A在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点点评：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体称为穿梭载体。16.反重序列可以回折形成发夹结构17.λ噬体线性分的两端各有一个（）个碱基组成的天然黏性末端参考答案：B点评：λ噬菌体线性DNA分的两端各有个12个碱基组成的天然粘性末端，称为cos位点。18.下关细菌人工染色体BAC的特点描述，除（）以外都是正确的参考答案：B载体在大肠杆菌中为高拷贝点评：细菌人工染色体。是基于大肠杆菌的质构建的高通量低拷贝质粒载体。包严谨型控制的复制区oriS、启动复制的由ATP驱的解旋酶（RepE及三个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因座（，parB和parC等元件。19.粘（cosmid是一种人工建造的载体，下列对它的描述中哪一项是不正确的（）D进入受体细胞后，可引起溶源化反应点评：粘粒指带有将DNA包到噬菌体颗中所需的cos序的质粒。包括质粒复制起点，可以像质粒一样转化并增殖；包括cos位点，可以像噬菌体颗粒一样包装、侵染。20.松型粒A在主细胞中拷贝数较多点评：理解松弛型质粒的概念。21.关质的不相容性，下列哪一种说法正确（）参考答案：如两个质粒不相容，说明它们的复制机制相同点评：利用同一复制系统的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指第二个质粒导入后，在不涉及限系统时出现的现象。22.一情下，质粒的存在情况以下描述正确的是（）A独存在

点评：质粒指细菌或某些低等生物里面存在的独立于染色体外的双链闭合环状分（在也发现有线状的经常携带一些不必需的遗传信息。23.转子包括下列哪个部分（）D重复序列点评理解转座子的概。24.下哪项不是质粒载体必备的基本特征（）D含lacZ点评：lacZ是一种筛选标记，能够使载体使用的更加方便，但不是载体必需元件。25.质的失和染色体的突变是不同的，表现在（）参考答案：A前者不能恢复，后者可以通过回复突变恢复该基因的性状评：理解回复突变。26.以的述中，哪一项是正确的（）参考答案：C如果细菌的某种表型特征在处理下丧失后不再恢复，这种表型有可能是质粒赋予的点评：了解质粒的生物学性质及质粒载体的工作原理。27.线质复制的引物来自于（）参答案：D自末端的端粒序列点评：参照染色体的复制。28.下关松弛型质粒的性质描述中是正确的A通常带有抗性标记点评：氯霉素可以增加质粒的复制，而不影响染色体的复制。是一用作遗传工程载体的自质粒，以下对这种质粒描述不正确的是（）B具四环素抗性点评：是自然质粒，没有四环素抗性因，不能通过抗性筛选30.以不表达载体所必须的条件是（）启动子不需要受控制点评：表达载体与克隆载体相比就是多了表达所必须的各种遗传元件。四简题何为体一理的体应备些点参考答案：将外或的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点必须具备合适的酶切位点，供外源片插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。含或（）复制的是何制，调机如？参考答案：复制式：在复制，首先合成前RNA，即引物，并与形杂交体；而后RnaseH切割前Ⅱ成为成熟的Ⅱ成三叶草二级结构物导质粒的复制机的RNAⅠ可控Ⅱ成二级结构，同时Rop增强RNAⅠ的作，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNA和Ⅱ之相互作用的突变，将增加带有pMB1或ColE1复制子的拷贝数。当向菌养中入霉素，以细质的贝得扩，分其理？参考答案：pMB1质的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶DNA聚合酶Ⅰ，聚酶Ⅲ赖的聚酶，以及宿主基因和的产物。因此，即使存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时带有pMB1（或ColE1）复制的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2千质粒。抗性因gene）目使的广泛选标，用抗素性哪种并两说其原？参考答案：氨苄青霉素抗性基（环抗性基因（tetr霉抗性基因（那霉素和新霉素抗性基因neor以及琥珀突变抑制基因。霉素抑制细胞壁肽聚糖的成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。Ampr编一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性素核体30S亚基的一种蛋白质结合抑核体的转位。Tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。何为α？何利来筛选入外DNA的组粒参考答案：α-complementation指基上缺失近操纵基因区段的变体与带有完整的近操纵基因区段的β半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α-complementation是基于在两个不同的缺陷β－乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α主有两部分组成：LacZ，在F质或染色体上，随宿主传代；LacZ'在载体上作为筛选标记在LacZ'中插入一个片断后不避免地导致产生无α能的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG和底物（时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－乳糖苷酶，不能分解X-gal，现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现

兰色。以此达到筛选的目的。6.为么生型噬菌DNA不宜为因程体参考答案：①生型噬菌体DNA没有容载能力因噬体的头部对包装的量是有限制的不大于基因组的105，所以要将噬菌体改造成载体，必须削减分子；②野生型的噬体对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；③没有可供选择的标记；④野生型的λ噬体具有感染性，因此不够安全。试简λ噬菌的LyticgrowthLysogenicstate两种环分及调过程参考答案：growth是λ噬体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬体颗粒，导致宿主细胞裂解。Lysogenicstate为λ噬菌体基因组通过位点专一性重组整合到宿主染色体中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由染数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则源化的频率就越高。溶源现象的生化媒介可能是cAMP，在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个重要的调节因素是噬菌体的Ⅱ蛋，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体整合到细菌的染色体中去。高浓度的C蛋白促进溶源化，而低浓度的Ⅱ蛋促裂解生长。当Ⅱ蛋浓度足够时，激活C蛋白和基因int的达，导致噬菌体与色体整合，朝着溶源态生长。用λ噬菌体载进gene，主要用噬菌的物特作择记其有cI失活Spi选请什叫cI筛选什叫Spi筛选参考答案：Ⅰ蛋控制溶源态的形成，裂解生长受到抑制，当外源基因片段插入Ⅰ中，Ⅰ蛋白活，溶源态打破而进入裂解生长而筛选出重组克隆，叫做c筛选。野生型噬菌体在带有原菌体的溶源性E.coli中生会受到限制的表型，称作Spi+，对P2噬体干扰敏感（sensitivetoP2果λ噬体缺少个参与重组的基因red和gam时带有chi位点宿主菌为rec+可在溶源性E.coli中长良好，噬体的这种表型称作Spi-。因此，通过λ噬体载体上red和或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬体简述λ噬菌载的隆理一步？参考答案：噬体载体属于克隆载体用于克隆片作理：λ噬体载体克隆外源片断的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上有许多差别。载体和外源片经过酶切后，外源片插入到载体的适当位置置换载体的填充片段这种连接后的组保留增殖性能但于分子量太大，不能象重组质粒那样可通过转化方法进入大肠杆菌。通过取λ噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重组噬菌体进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒保对大肠杆菌的感染能力，可将被包装的重组噬菌体注射到宿主菌中。通过裂解生长，可增殖重组噬菌体克隆步骤：①通过裂解过程增殖载体；②载体与外源的酶切；③外源与体的连；④重组噬菌体的体外包装；⑤包装噬菌体颗粒的感染；⑥筛选。10.Cosmid的工原是么参考答案：粘载体的主要原理类似噬菌体载体。在外源片断与载体连接时，粘粒载体相当于λ噬体载体的左右臂，位点通过粘端退火后再与外源片断相间连接成多联体当联体与噬菌体包装蛋白混合时，λ噬体A基蛋白的功将切割两个位点将两个同方向cos位点之间的片断装到λ噬体颗粒中去些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时线状的重组就象λ噬菌体DNA一被注入细胞并通过cos位点环化样形成的环化分子含有完整的粘粒载体象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源NA片断通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中去了。11.构建粒库会到些题你如解？参考答案：利粘粒构建基因文库时会遇到许多困难：①载体分子会自身连接，从而导致效率大降低甚至失败过载体作去磷酸化处理使用双位点载体或对载体的酶切产物进行分补平可解决这一问题多个外源片断插入载体中将个本来不相连的片认为是基因组中的连续DNA片断收集～45kb的分酶切外源片与载体连接、使用双cos位载体或对载体和外源片断的酶切产物进行部分补平，可解决这一问题。③提取的基因组DNA长度小于，使部分酶切后形成的35～45kb片断只有少

部分在其两端带有酶切位点致目标的可用性大大降低在外源片断作部分酶切之前应检查其大小，如果小于200kb则能用于构建文库；④提取的总纯度不高，可能由于出现酶解抑制物而得不到理想的酶切产物。因此，在制备总时，应小心避免混入的有机相和水相交界处的物质。如果问题依旧出现氯化铯梯度离心方法纯化或新制备总构建的文库中常常出现不含外源片断的克隆。这“克的比例依载体的同和操作的小心程度而不同一般而言使单位的载体约有％的克隆是空的使双cos位点的载体产空克隆的比例要低得多⑥不同重组质拷贝数可以有很大差异导致收获量相差悬殊。每当对文库作一次噬菌体的扩增，这些差异将会被进一步放大；⑦尽管文似乎全面，但也许不能获得目的克隆。限制酶位点的非随机分布、包装蛋白污染限制酶、重组引起的序列缺失扩增时目的克隆可能被淘汰等都是产生这种现象的原因。12.丝状菌克中常遇哪类问？用种法解？参考答案：①外区的部分缺失，克隆于丝状噬菌体基因间隔区的外源基因趋于不稳定。外源基因越大，缺失突变率越高，尽量避免带有让感染细菌在液体培养中连续生长，可以使这种现象减少最低限度（尽管不能完全消除确做法是用保存于－70℃重组噬菌体原种转染适当的宿主菌，铺成平板，并从隔良好的单个噬斑的中央挑取细菌进行小规模培养；②外源总是以单方向插入，实验中经常会遇到，尽管某一载体可能在两个方向上接受但定外源区却更容仅以其中一个方向插入该载体种况屡见不鲜所以出现这种现象为外源另条链上的序列不同程度地干扰了载体基因间隔区的功能。在多克隆位点区内遴选不同的位点插入外源或者选用可进行定向克隆的限制酶组合有时可避免上述问题。13.噬菌（）具那特？多phagemid都有个要缺，在助菌感染，时候链的产较低重性般差试析原？参考答案：①链既定，又高产，具有常规质粒的特征；②免却了将外源DNA片从质粒亚克隆于噬菌体载体；③由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源区的单链。原因：①噬菌体携带的基因间隔区的确切序列携完整基因间隔区的质粒可由于干扰辅助病毒复制而抑制子代噬菌体颗粒的产生基因间隔区插入质粒的具体位置，基因间隔区插入HindⅢ点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长，而将基因间隔区插入AhaⅢ位点则不然；③辅助噬菌体的性质，野生型丝状噬菌体及其抗干突变株都被用作辅助噬菌体助菌体基因间隔区插入了lacZ序列因而基因Ⅱ产物对它的识别不那么有效；④克隆于噬菌粒的外源的小与性质源片的大小而异的产量可以在5倍之间有所差般说越量越低一尚不清楚的原因相的外源DNA，其单链的量也参差不齐。14.载体有么的能元？什它克大段时有大优性参考答案：YAC带天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个复制起点，个端粒。能容纳长达几百kb的源，是质粒和粘粒办不到的。大片断的插入更有可能包含完整的基因，在色体步移中每次允许更大的步移距离，同时减少完整基因组文库所需的克隆数目。思考题问题：作一个最基本载体，它必须具备哪些功能元件？思考题问题：何α-互补？在载体构建中有何作用？思考题问题：请要描述噬体溶原态和裂解循环的基因调控模式，及其在构建载体中的作用。思考题问题：简辅助噬菌体的遗传学特性和生物学功能，及其在制备单链中作用。第四章一名解1.TAE醋缓冲液。由Tris碱醋酸和EDTA等分组成的缓冲体系，用于琼脂糖凝胶电泳。十二烷基磺酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳。用于检测蛋白质分子量的电泳方法，待分离蛋白质是变性的，泳动速率只与分子量相关，与本身所带电荷无关。SouthernblotSouthern杂。一种检测分子的方法。将片从琼脂糖凝胶转移到滤膜，结合了分的滤膜先与特定的预杂交液进行预杂交然后与标记的核酸探针和滤膜混合如果滤膜上的分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。在经过一定的洗涤程序游离的探针分子除去后，通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的分及其分子量。

Northernblot。用于检测细胞或织样品中是否存在与探针同源的mRNA分检测方法。过与Southern杂交相似，只不过在过转移的是RNA而不是。WesternWestern交。用来检测细胞或织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质的方法。将蛋白质品从SDS胶通过电转移方式移到滤膜，通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探不是DNARNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体Colonyhybridization菌落杂交。将细菌菌落影印到滤上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来，并之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含与探针同源的DNA。Dothybridization斑点杂交。直接将DNA或RNA分以点形固在膜然后进行分子杂交。核酸分的斑点面积小，在单位面积滤膜上处理的样数量就多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成DNA。S1酶图S1酸酶作图是专门用来分析核生物中原mRNA加切成成熟mRNA剪切位置的方法首先克隆得到待分析mRNA的组DNA片段，标记后用作探针，通过与mRNA杂成杂合链，然从S1核消化后条带的大小来判断内含子位置。Primerextension引物延伸。主要用于的5'端作图。首先在的的5'端下游约位处，设计一段互补寡核苷酸引物mRNA作模板转录酶延伸该引物的cDNA与mRNA互补且其长度与引物5'末端mRNA的5'末端间的距离相等。测定该cDNA的长度就可推算出mRNA的5'末置。二填空碱法提取质粒DNA的理（参考答案：在性条件下，DNA变性，在高盐条件下，只有超螺旋构象的质粒DNA复性。2.抽提含pBR322系粒的菌前，需在培养基中加入一定浓度的氯霉素，此氯霉素的作用（答案：提高拷贝数3.从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法有（参考答案：低点agarose；透析袋；电洗脱法Glass4.在的、纯化和检过程中，需控制RNA酶的活性，常用的RNA酶抑制剂有（考答案：人胎盘Rnase抑剂氧铜核糖核苷复合物；硅藻土在SDS离DNA时要注SDS浓度1%SDS的是不同的，前者（参考案：只将RNA离出来；可将和RNA一离出来6.预杂交的目的是（在杂液加（是参考答案：封背景；预杂交；防止探针与膜结合7.在Southern中，DNA经脂凝电后常NaOH理原参答：使DNA性，形成单链8.NorthernRNA时将RNA片转移到尼龙膜上，常用的转移方法有（考答案：毛细管；电转移；真9.原位杂交的定义是（交的对象可分为（）和（参考答案：原杂交就是将细菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释出，使固在膜。通过分子杂交，判断哪个哪些菌落含有与探针同源的DNA；杂交空斑杂交10.DNA针制备通常可分为均标记和末端标记，均一标记可分为（）和切口平移标记，切口移标记的原理是（参考答案：随即标记；利大肠杆菌DNA合酶Ⅰ外性和聚活性。通在待标记的

分上产生切口，该酶引发5'--3'外反应，在随后的聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸（dNTP合成的核酸链就带有标记物。11.SSC是由NaCl和檬钠组成的试剂中NaCl的用酸的作用考答案：溶解；作为螯合剂，抑制核酸酶的活性12.在个Southernhybridization过中，一需要防护有（（参考答案：紫照射；EB放射性同位素13.复是（交指（补单链重新配对恢复成双链；同源单链新配对恢复成双链。14.或RNA在交前，需将其转移到膜上，常用的膜有（）和（参考答案：硝纤维素滤膜；尼龙膜15.RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断，OD260为1时当于浓度为（参考答案：40g/ml三选题关碱解法分离质粒，面哪一种说法不正确（）参考答案：D质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性点评：质粒变了，但由于分子小，复性很快，而染色体DNA分子大，复性慢，来不及复性，而质粒分开用法分离质粒时染色体之以可以被除去，是因为（）参考答案：B染色体变性后来不及复性点评：碱法分离质粒运用的核心原理就是质粒的超螺旋构象。是离DNA时常用的一种阴离子去污剂，下列对其作用描述不正确的是（参考答案：D消除反应中的泡沫点评：消除反应中的泡沫的是异戊醇。用SDS酚抽提时浓十分重要，0.1%和1%的SDS的用分别）参考答案：B前者只能将RNA分出来；后者能将和RNA一起分离出来点评：SDS是种表面活性剂。从胞或组织中分离DNA时用蔗糖的作用（）参答案：C保护，止断裂点评蔗糖增加溶液的粘滞性，减小机械剪切，保护，止断裂。苯/氯仿/戊醇中，异戊醇的作用是（）参答案：A减少气泡，促进分相点评：苯酚：蛋白变性剂；氯仿：溶解痕量苯酚；异戊醇：减少气泡，促进分相。以保存的温度中，哪一种是最好的（）参考答案：D－℃点评：了解及它一些生物大分子的特性。在离过程造成分断裂的因素很多，下列说法中哪一项是不正确的（）参考答案：保液中未加一滴氯仿点评：保存液中加一滴氯仿的作用是防止真菌污染。在离的溶液中，Mg2离子浓度不能低于0.5mmol/L，否则（）参考答案：B核糖体解体点评：理解的离理。10.关cDNA的正确的说法是（）参答案：A以mRNA为板合成的双链DNA点评：正确理解的念。11.一典的哺乳动物细胞中，大部分的RNA为（）参考案：C点评：一个典型的哺乳动物细胞约含－5gRNA，中80％为rRNA，15％主要各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等～5％为mRNA。12.Agarose-EB电法分离纯化cccDNA的原理是（）参答：BEB不容易插入到cccDNA中，因而迁移速度快点评：了解cccDNA的质和EB的作原理。13.下哪项不是Southernblotting的步骤（）考答案：与体的连接点评：Southern的步骤有：酶切、电泳、转膜、杂交、检测14.blotting的DNA探针（）杂交参答案：D可与任何含有互补序列的DNA片段点评理解Southern的工作原理。

15.以关于T4多苷酸激酶标记5'端备探针的描述中（）是不确的参考答案：A能标记单链点评：T4多核苷酸激酶的活性催化ATP的－酸基转移至或RNA的5'末。16.以（方法才能说明外源基因进行了表达参考案：blotting点评：检测到mRNA只说基因录，检测到蛋白才能证明基因表达。Westernblotting是通过抗原抗体反应检测目标蛋白的方法。17.在口移方法标记探时只能用（）参答案：聚酶Ⅰ点评：熟悉这些酶的活性。切口平移方法标记探需要所使用的酶既有5'--3'的合活性，又有的外切活性。18.是由NaCl和檬酸钠成的试剂，其作用分别是（）参考案：A前是使溶，后者作为螯合剂，抑制核酸酶的活性点评：理解Southernblotting的作原理。19.斑杂的缺点在于（）参考答案：D假性较高点评：斑点杂交指直接将DNA或RNA分以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行的分子杂交。杂交信号特别强，容易产生假阳性。20.菌杂筛选重组体时参考案：不要外源基因的表达点评：因为菌落杂交是一种杂，所以不需外源基因的表达。21.以对杂交率的影响素描述中，不正确的是（）参答案：C重性探针不可以增加杂交率点：理解Southernblotting的作原理。22.与Northernblotting的别在于（）参考答案：A印记的对象不同，前者是对，者是对RNA点评Southernblotting是针对DNA的测手段。Northernblotting是针对的测手段，blotting是针对蛋白质的检测手段。23.切平是指在（）的作用下，使（）带上放射性标记参答案：B聚酶Ⅰ,DNA点评：掌握探针标记的方法。24.用疫学法筛选重组体的原理是（）参答案：A根据外源基因的表达点评：免疫化学法筛选使用的是蛋白质的抗原抗体反应。25.以不于核酸探针的是（）考答案：D抗点评：抗体为蛋白质探针，用于Westernblotting。四简题分析较脂凝电和聚烯胺胶泳异点参考答案：琼脂和聚丙烯酰可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分离片大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳丙烯酰分离小片段DNA5-500bp果较好分辨力极高至相差的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行电。琼脂凝电中简影响DNA凝中移率因？参考答案：①的子大小分越大则擦阻力越大也越难于在凝孔隙中蠕行而迁移得越慢；②琼脂糖浓度一给定大小的状片断其移速率在不同浓度的琼脂中各不相同分的构象；④电源电压，在低电压下，线状DNA片断的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着子量的增加，高分子量片的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有分离范围缩小；⑤电场方向；⑥碱基组成和温度；⑦嵌入染料的存在；⑧电泳缓冲液的组成。梯度衡心分质和色DNA的原？参考答案：①是种高分子量的重属，在一定的高速离心下，可以自动形成的度梯度；②当进行离心时，CsCl溶中的大分子物质将根据它本身的密度停留在不同的密区，形成一个致密带，而不会像一形成浓度梯度。溶液中大分子到底在何处形成带，将取决于大分本身的浮力密度。的力密度大约为，心时将迁移到CsCl的密度为1.7g/cm3处与此相，蛋白质的浮力密

度相当低，将漂浮在离心管的顶部。而RNA则淀于离心管的底部；③溴化乙碇存在的密度梯度离心中，能将超螺旋的DNA与非超螺旋的分开来。嗅化乙碇可嵌入到的双螺旋分子中，使部分解旋，其结果可使线性的力密度减少。由于超螺旋的DNA没游离的末端，解螺旋的幅度有限，也就只能结合有限的EB，此，超螺旋的浮力密度只有少许下降，大约为。结果，超螺旋的将线性、环的在EBCsCl密梯度离心中由于密度不同而分开。小量备粒DNA用粒特的切发切不，分可原及服法参考答案：①Ⅰ前没用洗涤，导致细菌菌株的细胞壁成分抑制限制酶的活；②