microRNA在白血病与肿瘤中研究进展

RNA的种类及主要功能种类作用核糖体RNAsRibosomalRNAs,rRNAstranslation翻译作用转运RNAsTransferRNAs,tRNAsTranslation翻译作用信使RNAsMessengerRNAs,mRNAsproteintemplate蛋白模板非编码RNAsNoncodingRNAs,ncRNAsvarioustypesandfunctions不同的种类和功能第一页，共25页。NON-CODINGRNA:FORMERLYKNOWNAS“JUNK”RNATranscriptsProtein-codingmRNANon-codingRNATranscriptsRegulatoryRNAmiRNAsiRNAAnti-senseRNAsnoRNAsHousekeepingRNAstRNArRNAsnRNAtmRNAsRnasePRNAsvRNAsgRNAsMRPRNAsSRPRNAsTelomeraseRNATranscription/chromatinstructureregulatorsTranscriptionalregulatorsProteinfunctionmodulatorsRNA/Proteinlocalizationregulators第二页，共25页。non-codingRNA非编码RNA(20-20000nt)RNAmRNAsmallnon-codingRNA(miRNA)小非编码RNA(20-500nt)longnon-codingRNA(lncRNA)长非编码RNA(>500-20000nt)第三页，共25页。MiRNA定义：

微小RNA(microRNA,miRNA)是一种长度约为22-28nt的非编码小分子RNA，miRNA通过与靶mRNA3’UTR(UntranslatedRegions,即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段)完全或不完全的互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制，从而调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡。它们通过miRNA介导的特异性的基因沉默导致靶mRNA降解及抑制蛋白质的合成调控转录后基因表达水平。miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用。第四页，共25页。MiRNA特征：MicroRNA是一种长度约为21nt的单链非编码小分子RNA。在进化过程中高度保守。其通过与靶基因序列的3’UTR区特异性结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其翻译。MiRNA预计调控超过60%的蛋白编码基因并且参与近乎所有已知的细胞进程。第五页，共25页。miRNAs的发现1993年，miRNA由哈佛大学VictorAmbros和GaryRuvkun首次发现

(lin-4)2000年，第二个miRNALet-7

在由哈佛大学博士后FrankSlack发现(Ruvkunlab)VictorAmbrosGaryRuvkun第六页，共25页。miRNA的研究思路表达谱分析生物信息学分析miRNA表达调控miRNA研究mRNA作用机理信号通路探讨表观遗传学miRNA功能研究过表达试验抑制表达试验靶标确证第七页，共25页。miRNA的研究方法1.miRNA芯片技术

将目前已经克隆的miRNA或潜在miRNA制备成探针固定在尼龙膜或其它固相支持物上，然后与不同组别的总RNA或细胞器RNA杂交，通过信号的强弱比较探讨miRNA的表达状况。该方法类似于基因芯片技术，具有高通量、快速等优点，是目前疾病相关miRNA筛选常用的一种技术。qRT-PCRNorthernBlot原位杂交技术等RNA-seq第八页，共25页。miRNA芯片是目前筛选和研究miRNA调控的高通量手段第九页，共25页。RNA-seq是另一种高通量研究方法RNA-Seq:arevolutionarytoolforTranscriptomics，Nature,2009,10:57第十页，共25页。有些miRNA具有类似抑癌基因功能，通过转录后负性调控致瘤性靶基因的表达而发挥生物学功能；有些miRNA具有类似癌基因的作用，通过下调抑瘤性靶基因的表达而发挥功能。恶性肿瘤的microRNA结构与表达异常

恶性肿瘤相关性microRNA如果组织中某种或某些miRNA的表达失常，细胞内许多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表达失常，从而导致肿瘤的发生。第十一页，共25页。有些miRNA具有类似抑癌基因功能，通过转录后负性调控致瘤性靶基因的表达而发挥生物学功能；有些miRNA具有类似癌基因的作用，通过下调抑瘤性靶基因的表达而发挥功能。恶性肿瘤的microRNA结构与表达异常

恶性肿瘤相关性microRNA如果组织中某种或某些miRNA的表达失常，细胞内许多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表达失常，从而导致肿瘤的发生。第十二页，共25页。原癌基因与抑癌基因原癌基因（proto-oncogene）癌基因(oncogene)Myc抑癌基因(cancersuppressorgene)p53第十三页，共25页。miR-21

（1）miR-21在乳腺癌、肝癌、脑瘤等多种恶性肿瘤中表达显著上调，并与乳腺癌等肿瘤的恶性分级呈正相关；（2）miR-21可能通过抑制其靶基因TPM1(tropomyosin1)的表达而促进胶质瘤细胞的增殖。（3）miR-21通过负调控抑癌基因PTEN的表达，促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力。（4）通过抑制PCD4(programmedcelldeath4)mRNA的翻译效率，抑制MCF-7的增殖。（一）致瘤性microRNA（onco-miRNA）

在microRNA(miRNA)家族中，有些miRNA具有类似癌基因功能，与肿瘤发生呈正相关，这部分miRNA称为致瘤性miRNA（onco-miRNA），其过表达或持续活化将直接导致肿瘤的发生发展。第十四页，共25页。

let-7家族(1)Let-7是2000年由Reinhart等在线虫中发现的一种具有转录后调节作用的miRNA，通过转录后调节lin-47和lin-51的表达而控制线虫向成虫的转变。(2)Ras是Let-7的直接靶基因，受到let-7家族的负性调控。Ras是一个膜相关的GTPase信号蛋白，具有调节细胞生长、分化的功能，是一个重要的瘤基因。(3)在肺癌、乳腺癌、子宫癌等恶性肿瘤中，let-7家族与这些肿瘤有关的脆性位点密切相关，在肺癌中其表达下调，是一个与肺癌预后负相关的抑癌基因。（二）抑瘤性microRNA(suppressormiRNA)

在miRNA家族中，有些miRNA具有类似抑癌基因功能，与肿瘤发生呈负相关，称为抑癌性miRNA（suppressormiRNA）。抑癌性miRNA的表达下降或者缺失，将直接导致肿瘤的形成。

第十五页，共25页。16

miRNA与肿瘤发生的关系存在两种可能的模式[Caldas,etal.（NatureMedicine2005）]：1、若miRNA表达上调，其对应抑癌基因表达下调时，则可能导致肿瘤发生；2、若miRNA表达下调，其对应癌基因表达上调时，同样可能导致肿瘤发生。第十六页，共25页。癌症相关miRNAs举例癌症类型高表达miRNA低表达miRNA脑肿瘤miR-10b,21,22

miR-128,181肺癌miR-17-92,17-3p,93,106a,155,let-7Let-7,miR-145乳腺癌miR-10b,21,155miR-125,145肝癌miR-18,224miR-122a,125a,195,199a,200a大肠癌miR-21,31,96,135b,183miR-133b,143,145

胰腺癌miR-21,103,107,196amiR-204

慢性B淋巴细胞白血病miR-21,23a,23b,24-2,146,150,155,181a,211miR15,16,29c,192,222急性淋巴细胞白血病miR-99a,100,125b,155,196a,196b,383,miR-29a,b,c,320a,494,708,let-7b,7c第十七页，共25页。恶性肿瘤microRNA的转录调控异常（转录因子-microRNA-靶基因”交互作用的分子网络）1．转录因子对microRNA初级转录产物的调控2.microRNA对靶基因的调控

大部分miRNA具有自己一套独立的顺式作用元件（启动子和增强子序列），受到上游一系列转录因子的调控。类似于蛋白编码基因的转录过程，这些转录因子通过与miRNA的顺式作用元件结合，调节miRNA在转录水平的表达。miRNAs与其靶基因3’-UTR的结合位点并不是完全互补，可以存在短的错配和G-U配对，因此，miRNA调控多个靶基因。同时，同一个靶基因又同时受到多个miRNA的调控。miR-21→TPM1、PCD4和PTEN；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195→bcl-2第十八页，共25页。

因此，一个转录因子可以调控多个miRNA分子，一个miRNA分子又同时受到多个转录因子的调控；同时，一个miRNA分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子的协同调控；它们之间组成了错综复杂的调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程的精细调控。3．“转录因子-microRNA-靶基因”构成复杂的分子网络第十九页，共25页。microRNA与肿瘤的诊断和治疗肿瘤的分子诊断与治疗是分子医学的重要组成部分，已成为当前肿瘤研究领域的热点。一些具有重要诊断和治疗价值的分子标志物已经在临床上得到了广泛的应用，但由于特异性、敏感性或靶向性等方面的因素，其临床应用仍然受到很大局限。由于miRNA在肿瘤多阶段发生过程中具有独特的表达特征和生物学功能，miRNA在肿瘤的分子诊断和治疗中具有广泛应用前景。第二十页，共25页。一、microRNA与肿瘤的诊断(一)肿瘤组织特异性表达标志物miRNA表达特征来对肿瘤进行分类，并且筛选能对肿瘤进行预后评估的miRNA标记。Lu等通过对多种组织来源肿瘤组织miRNA（约200个）表达谱进行归类，发现这些结果与肿瘤组织的胚胎来源一致。例如，内皮起源肿瘤，如直肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一类，血液系统来源的也被归为一类。而16000个蛋白编码基因的mRNA则不能将其聚在同一类。因此，肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源，这也与miRNAs指导组织特异性发育功能相一致。1.肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源第二十一页，共25页。许多的研究通过miRNA芯片技术系统研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血病等肿瘤组织与其正常组织中的差异表达，构建了相应肿瘤组织与正常组织差异miRNA表达谱，筛选出了一些具有临床诊断价值的分子靶标。如，miR-221、miR-301和miR-376a诊断胰腺癌。(2)miRNA指导临床肿瘤诊断（3）miRNA非常稳定福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库的建立成为可能。第二十二页，共25页。(二)肿瘤血清标志物血清的获得相对比较简单、对病人创伤少，因此肿瘤血清标志物越来越受到广大医学研究者青睐。（1）miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以避免接触RNases，在严酷的环境条件下仍能保持稳定。（2）miRNA在血浆和血清中稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值非常吻合。第一个被发现的血清miRNA标志物是miR-21。Lawrie等人证实，弥漫性大B细胞淋巴瘤病人的血清miR-21水平很高，与淋巴瘤存活率呈负相关，是一个淋巴瘤预后预测的理想分子