SSH技术与其应用3

引言

基因在时间和空间上的有序表达贯穿和调控了个体发育和疾病发生的整个过程。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的奥秘，而且还为生物的改良、基因诊断与治疗提供重要的理论依据。第一页，共27页。差异表达基因的克隆Liang和Pardee等1992差异显示（mRNAdifferentialdisplayreversetranscription）技术Hubark1994RAD(Repesentationaldifferenceanalysis）技术Diatachenkol1996SSH(suppressionsubtractivehybridization)技术Josn1998DSD(differentialsubtractiondisplay)技术Affymetrix.Co.1991cDNA微阵列(cDNAMicroarrays)技术第二页，共27页。原理

SSH是建立在抑制PCR与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。杂交二级动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。抑制PCR是利用链内退火优于链间退火的特点．使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。第三页，共27页。第四页，共27页。第五页，共27页。第六页，共27页。抑制消减杂交技术的关键tester与driver要配对密切，最好双方是共源细胞株，这样双方才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系密切，从而减少工作量、减少下一步工作的盲目性。在选用限制内切酶时应尽量选用对于基因组DNA是酶切位点较少的限制内切酶，使酶切后产生的片段尽量大一些。接头要含有酶切位点以连于平端cDNA上，重要的是要在其末端含有一段反向末端重复序列，这使得在PCR反应中能选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA片段的扩增。第七页，共27页。SSH技术的应用发育基因的克隆疾病相关基因的克隆各种受体蛋白质相关基因的克隆免疫调控基因研究代谢调控机理研究第八页，共27页。SSH技术的优点对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。简便易行：本技术所采用的技术方法简单，成熟，易掌握，易操作。灵敏度高：用抑制消减杂交技术，仅需1~2μg的mRNA，而mRNA差异显示技术需20μg的mRNA，cDNA消减杂交需至少200μg的mRNA。重复性好，阳性率高达94%。快速：一般3~4d即可获得差异表达基因片段的cDNA。第九页，共27页。SSH技术的不足消减库中的cDNA经过RsaI等限制酶消化后，不再是全长cDNA。当然，可以用这些基因片段为探针等方法从cDNA文库中钩出全长目的基因。不能对差异表达进行定量。不能同时对数个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测。第十页，共27页。SSH技术的展望分离、克隆抑制肿瘤细胞生长、增殖．并诱导肿瘤细胞向终末分化和凋亡的相关基因。运用大范围系统的基因组技术钓出药物应答基因,可有选择地给病人用药。分离、克隆植物发育相关基因及发育调控基因，有助于了解植物体生命活动的规律和机制．并为寻找有效控制作物生长发育、提高作物产量及改善品质提供理论基础和依据。分离并克隆包括抗虫、抗病毒、抗真菌、抗除草剂、抗逆和高品质在内的生物或非生物逆境信号诱导表达的优良性状相关基因，并转人植物，将使作物遗传育种的广度、深度及速度产生巨大飞跃。随着基因芯片技术的成熟，可将SSH与Microarray结合用于差异基因的大规模快速筛选鉴定。第十一页，共27页。发育基因的克隆

发育过程中调控基因的分离与鉴定是当今分子发育生物学的重点研究内容。Kim等用SSH筛选出香石竹花成熟过程中发育调控基因CFMI。Morozov等研究了人着床前胚胎发育过程中阶段特异性基因表达情况。Kochilas等利用SSH方法研究了胚胎发育过程中心肌分化有关的差异表达基因。睾丸特异表达基因的研究。第十二页，共27页。疾病相关基因的克隆癌细胞的表达图谱:乳腺癌、人结肠癌、前列腺癌、Zanders等用SSH和微阵列杂交，比较RA组织和正常组织的表达图谱差异。脑组织中央脑动脉阻塞引起的暂时或永久性局部缺血时的差异表达基因。大鼠高转移胰腺癌细胞抹与低转移细胞抹比较。第十三页，共27页。各种受体蛋白质相关基因的克隆

Kuang等，比较雌激素ER受体阳性和阴性的乳腺癌细胞株的基因表达谱。第十四页，共27页。免疫调控基因研究T细胞杂交瘤比较获得一个新的TNF家族成员TRANCE基因，编码产物能调节T细胞依赖免疫反应。白血病细胞系Jurkat细胞与经PHA／PMA激活的Jurkat细胞比较。HL-60细胞与视黄酸诱导分化的HL-60细胞比较获得编码细胞表面LTB4受体的cDNA。第十五页，共27页。接头及引物第十六页，共27页。第十七页，共27页。试验组cDNA(与接头1连接)

对照组cDNA(过量)

试验组cDNA(与接头2R连接)第一次杂交cbad第二次杂交a,b,c,d+e补平末端cbda

a,d加入引物PCR扩增b→b′不扩增

线性扩增5′

5′3′3′

指数扩增ec不扩增与第十八页，共27页。总RNA制备

总RNA提取及纯化（TRIzol法）mRNA提取mRNA浓缩RNA质量和浓度检测第十九页，共27页。抑制消减杂交

cDNA第一链和第二链合成双链cDNA的RsaI酶切RsaI酶切检测Tester双链cDNA接头连接连接效率检测第一次杂交第二次杂交第一轮PCR扩增第二轮PCR扩增第二十页，共27页。消减效率检测第二