《乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒(12型)核酸检测试剂盒(PCR荧光法)操作规程》概述

苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺点病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR荧-光法）操作规程目的规范核酸检测试验操作，保证检测结果的正确性。原理2.1聚集：汲取8份（或以下）样品到指定的聚集管。2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。试剂盒供给以内比较(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和剖析的全过程。标本经裂解液办理后会将病毒外鞘膜损坏，蛋白质变形，使病毒裂解开释出病毒基因组核酸。加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。洗液能够洗去未联合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR克制物等并降低盐浓度。纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。2.3扩增：采纳PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一起经过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守地区，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反响系统中带荧光标志的第1页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日TaqMan探针，跟着PCR的进行，荧光信号不停累积。经过PCR仪的检测血液标本达到和超出荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。选择性PCR扩增：采纳UNG-dUTP抗污染系统。在PCR扩增系统中采纳UTP代替TTP，产生大批U-DNA片段。UNG酶特异辨别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不可以作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，进而防备了PCR扩增产物的污染。2.4质量控制原理为监控实验进行，保证明验结果的正确，在每次检测过程依赖阳性、阴性质控品以及内标进行监测。阴性质控品监控系统性假阳性，假如阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，所以实验中的阳性结果需复查。低浓度阳性质控品监控系统假阴性，假如低浓度阳性质控品检测结果为阴性，说明实验存在假阴性或敏捷度降落的风险，所以实验中的阴性结果均需复测。内比较分为DNA内比较和RNA内比较，是每个反响管中的阳性质控，用第2页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日于监控单个反响管中DNA与RNA的假阴性风险，假如标本检测结果为阴性，其DNA内比较与RNA内比较结果一定为阳性，不然提示该标本的扩增遇到抑制，该阴性检测结果有假阴性风险，需要复测。合用范围合用于核酸实验室采纳核酸技术进行的HBV、HCV、HIV三项单管混样检测。职责4.1受权的查验人员负责试验操作、结果判读，作好有关记录，对检测结果的真实性和有效性负责。4.2受权的监察人员负责监察该规程履行。5.原始样品系统血浆6.资料与设施6.1耗费品乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺点病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法），苏州华益美生物科技有限企业；孔深孔板离心管（手工实验用）和2mlAxgen离心管（用于配置PCR反响液）；聚集管；孔扩增板或八连管；带滤芯并经灭菌办理的Tip头；第3页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日自封袋；磁棒套管；留样板和封膜6.2设施全自动样品办理系统；核酸萃取仪；荧光定量PCR仪；7.检测环境7.1切合二级生物安全实验室条件。工作环境要求空气流通、照明充分；室内环境整齐、洁净并配有消毒设施。7.2实验室温度：20-30℃；湿度40-60%。程序步骤8.1试剂准备区操作耗费品的准备和深孔板反响盘的预分装惯例实验盘点当天试验所需的耗费品，移送标本制备区，并做好记录。手工实验预分装清洗液A、清洗液B、洗脱液，需充分混匀，使用移液器分派至反响盘L-2可于前一工作日预分装4.2ml核酸萃取液到5ml管；反响液的配制惯例操作第4页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日从-20℃冰箱拿出试剂的反响液A、反响液B、反转录酶、RNA保护剂、Taq酶；室温溶解、均衡（反响液的配制时间应控制在15—20分钟，则均衡时间大概10分钟），于震荡器上充分混匀。转/分别心30秒以除去气泡。改换无粉手套；标志2ml离心管（配制量、使用日期），依据下表配制反响液（反响液量为n（标本数目

组分用量反响液A10μl/T反响液B10μl/T反转录酶1.5μl/TRNA保护剂0.5μl/T/8）+4（NC、PC、室内阳性质控品、阴性质控品各一孔）Taq酶1μl/T+2人份（充裕量）。于震荡器上充分混匀，手动高速（5000转）离心约20秒以除去气泡。将配制好的反响液送交标本制备区，也可短时（5min以内）存于4℃冰箱。手工操作同至。乳胶手套外戴上薄膜手套，取用扩增板或八连管于托盘上。将配制好的反响液依据H`-A`固定方向挨次分派，每孔20μl（吸头垂直加样，防止碰钉子），分派数目为n（标本数目）+4（NC、PC、室内阳性质控品、阴性质控品各一孔）。目测每孔能否足量、超量。分派好的扩增板或八连管放入自封袋中，于袋上标志，经过传达窗送交标本制备区，也可短时（5min以内）存于4℃冰箱。8.2标本制备区操作第5页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日标本准备：将标本按次序转移到32孔样品架,条码面向右边，使用STAR将标本管献血码扫描入“**/NAT_TEST_RECORD”中；剔除酶免、ALT检测反响性标本。在生物安全柜中逐一去除标本管管盖。依据《核酸实验室血液检测表记的管理程序》粘贴聚集管、深孔板、留样板所需条码。惯例试验【HAMILTON–MSS系统准备流程】1.保证仪器正常通电，要求使用不中断电源(UPS)检查荒弃吸头采集框能否套有一次性垃圾袋（每次实验后立刻清理并改换新的垃圾袋）启动HAMILTON工作站模块及对应电脑电源，注：应先开电脑，后开机器4.启动MeDiProSuperPureSystem-32工作站模块电源，开启模块紫外灯自动照耀10分钟【HAMILTON–MSS系统实验流程】1.装载加样尖到HAMILTON工作站模块加样尖地区。2.装载96孔反响盘到HAMILTON工作站模块反响盘地区。3.装载PCR扩增反响盘到HAMILTON工作站模块反响盘地区。4.装载试剂槽到HAMILTON工作站模块试剂地区。5.拿出核酸萃取液、载体RNA和内标，均衡至室温，并充分混匀。按下表所列方案配制混淆液。核酸萃取液4.2ml/testn×载体RNA10μl/test×n内标5μl/test×n注：n=待测样本数6.拿出核酸萃取液/载体RNA/内标混淆液、清洗液A、清洗液B、洗脱液和磁珠悬液，充分混匀，分别加入对应的试剂槽。第6页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日7.运行试剂分装程序，将核酸提取试剂分装入96孔反响盘中。试剂散布见下表。反响盘L-2（所列为左半边模式，右半边与左半边同样）1/72/83/94/105/116/12A/清洗液A/清洗液B/洗脱液B/清洗1ml液A/1ml/100μl清洗液B洗脱液C/清洗1ml液A/清洗1ml液B/100μl洗脱液D/清洗1ml液A/1ml/100μl清洗液B洗脱液E/清洗1ml液A/1ml液B/100μl清洗F/清洗1ml液A/1ml/100μl清洗液B洗脱液G/清洗1ml液A/1ml液B/100μl洗脱液清洗1ml液清洗H/A/清洗1ml液B/100脱液μl洗插入标本载架、聚集管载架到HAMILTON工作站模块对应地区。运行标本聚集程序，达成标本聚集。取掉标本管载架，整理标本并2~8℃暂存。运行核酸提取程序，进行聚集标本的裂解，而后分装入96孔反响盘中，详细分装见下表。反响盘L-1（所列为左半边模式，右半边与左半边同样）1/72/83/94/105/116/12A900μl900μl900μl900μl900μl900μlB900μl900μl900μl900μl900μl900μlCMixμl900Mixμl900Mixμl900Mixμl900Mixμl900MixμlD900MixμlMixμlMixμlMixμlMixμlMixμl900900900900900900EMixμl900Mixμl900Mixμl900Mixμl900Mixμl900MixμlF900MixμlMixμlMixμMixμlMixμlMixμl900900900900l900900GMixμl900Mixμl900Mixμl900Mixμl900Mixμl900MixμlH900MixμlMixμlMixμlMixμlMixμlMixμl900900900900900900Mix酸萃取液Mix载体内Mix标混淆液Mix加入样本后Mix的萃取混淆Mix液。注：Mix为核/RNA/目测反响盘（深孔板），检查分派的试剂能否达量；硅胶盖（经75%酒精浸洗，紫外线灯照耀）封反响盘L-1，封板膜封反响盘L-2，并压实。12.96孔反响盘移入MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取模块中。13.履行下表所示的MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取程序，进行核酸提取。第7页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取程序Lysis-4200反响盘L-1槽位混淆时间磁吸时加温时间磁混淆速体积暂m间sm棒度ul停11500ON中900OFF21500ON中900OFF31500ON中900OFF41500ON中900OFF51500ON中900OFF61500ON中900ON反响盘L-2槽位混淆时间磁吸时加温时间磁混淆速体积暂m间sm棒度ul停22500ON中1000OFF42500ON中1000OFF6106010ON中100OFF4100OFF中1000On注：程序第一次暂停时移出反响盘L-1，换上反响盘L-2，按「RUN」持续执行程序，达成核酸提取。将反响盘L-1底部固定上金属条（固定于反响盘第6和第12列处）后置于MeDiProSuperPureSystem-32机器上（使用前经紫外线灯照耀20min），调用并履行程序“Lysis-4200”。待机器第一次鸣叫时（暂停），取下反响盘L-1；将反响盘L-2固定上金属条后置于机器上，按“自动运行”让程序持续履行。待机器再次鸣叫，程序结束（使用后紫外线灯照耀20min）。取下反响盘b卸取金属条，反响盘b的第6或第12列孔内的洗脱液即为PCR扩增反响用核酸模板。将反响盘L-2置于STAR指定地点。达成核酸提取的96孔反响盘回HAMILTON模块中。拿出扩增反响液A、扩增反响液B、逆转录酶、RNA保护剂和Taq酶，配制PCR扩增试剂，充分混匀，搁置于2ML离心管中，从试剂准备区转移到标准制备区，第8页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日加入对应试剂槽。运行PCR扩增试剂分装程序，将PCR扩增试剂和提取好的核酸模板分装到PCR反响盘中。目测扩增板液体分派能否足量，封膜能否与扩增板粘贴密切，无气泡。如采纳八连管，应保证八连管盖盖紧，并置于载架上传达。17.PCR反响盘或八连管经过传达窗运行到ABI7500扩增仪，进行核酸扩增荧光检测。【HAMILTON–MSS工作站系统封闭流程】实验结束后，封闭HAMILTON–MSS工作站系统运行程序窗口,封闭模块电源，注：应先封闭机器电源，后封闭电脑取下节余加样尖盒,留作下次使用。取下荒弃吸头采集框的垃圾袋扎好，转移至扩增去医疗垃圾暂存处，需高压灭菌后抛弃。标本架放入75%的乙醇中浸泡30分钟后拿出晾干备用。洁净垃圾袋上方的吸头挡板用酒精充分擦抹表面，晾干后备用。先后用微湿洁净布擦抹，再用含75%酒精棉纱擦抹工作台面。翻开MeDiProSuperPureSystem-32工作站模块紫外灯自动照耀10分钟。翻开实验地区固定紫外灯，照耀60min。实验地区进行1小时或1小时以上的通风。手工试验试剂准备（试剂准备区）1.预分装清洗液A、清洗液B、洗脱液，需充分混匀，使用移液器分派至反响盘L-2（试剂准备区）2将lysis置于室温均衡30min。（样本制备区）3保证室内温度在25℃左右。4将样本、IC、Ploy(A)RNA于室温溶解。（样本制备区）第9页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日样本办理（标本制备区）1.聚集操作：准备聚集所需要的适合数目的1.5ml管挨次粘贴聚集条码或标志POOL编号，并置于试管架上。用移液器（20-200μl）挨次汲取标本血浆150μl加入到对应的聚集管中，8份标本聚集为1个聚集管（pooling）；如标本数不足8份，则用均衡液将液体补齐至1.2ml。2.拿出核酸萃取液、载体RNA和内标充分混匀。3准备5ml冷冻离心管于试管架，标志，每管加入4.2mlLysis,10ulPoly(A)RNA,5ulIC,30ulBeads,1.2ml样品，混匀。4.每5min混匀一次，室温30min。5.按900ul/孔将混淆液Mix加入反响盘L-1中，6.将反响盘L-1底部固定上金属条（固定于反响盘第6和第12列处）后置于MeDiProSuperPureSystem-32机器上（使用前经紫外线灯照耀20min），调用并履行程序“Lysis-4200”。待机器第一次鸣叫时（暂停），取下反响盘L-1；将反响盘L-2固定上金属条后置于机器上，按“自动运行”让程序持续履行。待机器再次鸣叫，程序结束（使用后紫外线灯照耀20min）。取下反响盘L-2卸取金属条，反响盘L-2的第6或第12列孔内的洗脱液即为PCR扩增反响用核酸模板。将反响盘L-2置于磁力吸附架上靠磁，用移液器单孔或用八连排移液器汲取模板按40ul/test分派到已分装好扩增试剂的扩增反响盘或八连管中，覆膜或盖上盖子，经传达窗转移到扩增区。第10页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日8.3扩增检测区操作将经传达窗传达过来的96孔PCR扩增板放入荧光PCR仪ABI7500，按照右图设定程序进行PCR扩增。

步骤温度时间循环120℃5分钟1242℃35分钟1394℃10分钟194℃10秒4555℃15秒65℃45秒注65℃采集所有荧光信号扩增结束后将实验数据保留并进行结果判断。判断条件以下：质控品结果判断：剖析项内标HBVDNAHCVRNAHIVRNA备注检测荧HEXTAMRAFAMROXCY5阴性质控品Ct≤40Ct≤40Ct>45或无Ct>45或无Ct>45或无不然重测阳性质控品//Ct≤45Ct≤45Ct≤45不然重测待测标本结果判断：剖析项目检测荧光待测标本

内标HBVDNAHCVRNAHIVRNA结果判断HEXTAMRAFAMROXCY5Ct≤40Ct≤40Ct>45或无值Ct>45或无值Ct>45或无值三项病毒核酸均为阴性/Ct≤40Ct≤45Ct>45或无值Ct>45或无值HBVDNA阳性Ct≤40/Ct>45或无值Ct≤45Ct>45或无值HCVRNA阳性Ct≤40/Ct>45或无值Ct>45或无值Ct≤45HIVRNA阳性Ct>45或无值Ct>45或无值Ct>45或无值Ct>45或无值Ct>45或无值所有结果从头测定Ct>45或无值/Ct>45或无值//DNA结果从头测定/Ct>45或无值/Ct>45或无值Ct>45或无值RNA结果从头测定备注：“/”表示当其余条件知足时，该荧光通道结果可不做考虑。1.采纳归并检测的方式进行原始标本病毒的核酸检测。归并检测为病毒核酸阴性第11页共13页苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实行时间：2012年04月01日反响，该聚集池中的标本三项病毒核酸阴性。归并检测体现病毒核酸阳性反响时对归并检测聚集池标本进行拆分检测，精选出对应的病毒核酸阳性标本。最后对筛出的阳性标本进行确认检测。2.依据临床用血的要求，乙型肝炎病毒、丙型