终版题目核素标记多肽精氨酸

中 英 文献综第一章肿瘤分子显像技术研究进展 第二章肿瘤新生血管显像研究进展 参考文 正引言 第一部分：肿瘤血管靶向多肽RRL作用机制研 实验材 实验方 实验结 实验讨 参考文 第二部分：肿瘤新生血管显像剂RRL与肿瘤细胞关系研 实验材 实验方 实验结 实验讨 参考文 第三部分：新型小分子肽RRL理化性质及肿瘤分子显像研 实验材 实验方 实验结 实验讨 参考文 结 缩略 个人简 致 核素标记多肽精氨酸-精氨酸-亮氨（RRL）肿瘤分子显像实验研博士：卢霞学院：第一医院中文献精氨酸-精氨酸-亮氨酸(RRL)三肽序列能够特异性的靶向结合于饰RRL结构使其能够被放射性核素碘[131I]标记，列荷瘤鼠动物模型中对肿瘤新生血管有肯定的显像效果本课题期研究结果的基础上应用分子RRL特异性示踪肿瘤新生血管的分子机制进行初步的探讨；探索RRL多肽显像剂与肿瘤实质细胞的关系；进一步研究131I标记的RRL在不SPECT显像效果，以期研发一种新的，特合成十个氨基酸序列的小分子多肽RRL及对照肽，高效液相色谱(high-performanceliquidchromatography,HPLC和电喷雾质谱(electrosprayionization131IRRL与肿瘤认为血管内皮生长因子受体-2vascularendothelialgrowthfactortype2,VEGFR-2)RRLVEGFR-2酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记RRL,并与以上不同的细胞系共同孵育结合，激光共聚焦显微镜观察FITC-RRL(2μg/ml)在VEGFR-2蛋白表达量不同的细胞系中结合差异，以此提示RRL与VEGFR-2的关系。在24孔板内培养正常人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)、黑色素瘤细胞(B16)及人肝癌细胞(humanhepatocellularcarcinomacells,HepG2)，与131I-RRL(37kBq)结合后，井型γ计数及实质细胞结合RRL的不同能力。以FITC-RRL(2μg/ml)与以上前三验证RRL与不同来源细胞结合能力的差异。96孔板培养人肝癌细胞(HepG2)，应用不同浓度的RRL、FITC-RRL、131I-RRL、肝癌敏感化疗药物顺铂处理细胞后，CCK-8细胞检测试剂盒检测给予不同处理后存活的细胞状态及数量变化比较不同处理对肝癌细胞毒性作用的差异BALB/c鼠(2～4周龄)12只，饲养于无特殊病原体(specialPathogen ,SPF)级饲养环境。培养黑色素瘤细胞(B16)、血管肉瘤细胞(murinehemangioendothelioma,EOMA)、人肝癌细胞(HepG2)细胞(MCF7),取对数生长期细胞以5×106的密度接种于BALB/c鼠的右侧腋下，肿瘤长至约0.8cm大小，病理切片鉴定肿瘤组织成瘤特性，并进行SPECT显像，每只显像鼠尾静脉注射131I-RRL(7.4MBq)，注射后4、6、24、48、72h、10d131I-RRL在黑色素瘤模型鼠体内肿瘤组织的显像效果及代谢过程肝癌组血管肉瘤组及组肿瘤模型鼠注射131I-RRL(7.4MBq)24h131I-RRL在不同肿瘤中的SPECT显像效果。RRL序列为Try-Cyc-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cyc(RRL),两个半胱氨酸之间成环，其中Arg-Arg-Leu为活性结构域，合成的RRL分子量为1040Try-Cyc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cyc(GGG)，RRL肽99%。氯胺-T131I-RRL69%以上，放化纯大于96%，在37℃人新鲜中孵育24h后，其放化纯仍然大于91%式细胞仪分析结果与以上放射性计数测量结果一致。CCK-8细胞检测结果发现PBS对照组和RRL组细胞未见明显，RRL不同剂量组细胞存活率分别μg/ml)FITC-94.1%(50μg/ml)、91%(100μg/ml)、89%(200μg/ml)、56%300μg/ml)、44%34%(3μg/ml)、29%(4μg/ml)、19%(5μg/ml)；131I-RRL100%0kBq)、97.674kBq)、93.9370kBq)、58.6%740kBq)、(1480kBq)。不同时间点SPECT4h即有131I-RRL24h48h肿瘤组织有明显的放射性核素的浓聚，显像效果好，10d131I-RRL滞留于肿瘤组织内，131I-RRL在肿瘤部位的存留时间长。131I-RRL不但能够列、黑色素瘤肿瘤模型动物清晰特异性显像肿瘤组织在肝癌和血管肉瘤等多种组织中也能够特异性进行肿瘤分子显像。但是在肿瘤组织中未见明显放射性核素浓聚。研究结论RRL肿瘤分子显像作用分RRL本身发现它与多种不同组织来源的实质细胞有明显结合其结合的量甚至多RRL不仅如文献是新型肿瘤新生血管显像剂而且能够与多种实质细胞特异性结合是靶向分子示踪及靶向放射免疫治疗具有很大应用潜力的肿瘤分子[]：精氨酸-精氨酸-亮氨酸；多肽；肿瘤分子显像；131I；荷瘤鼠；新生StudyonanovelsmallpeptideRRLastumortargetingtracerinmalignantimagingandradioimmunotherapyPh.DCandidate: XiaLu Pro.RongfuWang PekingUniversityFirstHospitalMajor:ImagingMedicineandNuclearMedicineNumerouspeptideswhichspecificallycombindedtotumorangiogenicendotheliumhavebeenidentified,includingthetripeptidearginine-arginine-leucine(RRL).Radiopeptideswereofincreasinginterestsintumorimagingandtargetedradiotherapyoftumors.TheaimofthisstudywastoinvestigatethefunctionalspecisicityofRRLasatargetingtracerofmalignanttumorangiogenesisandtumorcells.AnimalprotocolswereapprovedbytheInstitutionalAdministrativePanelonLaboratoryAnimalCare.Inthisstudy,asmallpeptideRRLwasdesignedandsynthesizedandaquarterwaslabeledwithfluoresceinisothiocyanate(FITC).TheRRLpeptideandFITC-RRLweresynthesizedusingthefmocsolidphasemethodandthenidentifiedbyESI-MSysisafterpurificationbyHPLC. labeledwithnuclideiodine-131 theChloramine-T column.Then,humanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC),B16(mousemelanomacells),HK-2(humanrenaltubularepithelialcells)andHepG2(humanhepatocellularcarcinomacells)werecultured,131I-RRLandFITC-RRLwaspreparedtoco-culturewitheachcelllines.BygcountingandFlowCytometry,thedifferentaffinitytoRRLtoeachcelllineswasevaluated.Besides,HepG2wereculturedtotestthecytotoxicityofthecompoundsofRRL,FITC-RRLandcistinaswellas131I-RRLindifferentdeliverydosage.MicebearingB16melanomatumorsweregiveni.v.injectionsof131I-RRLtoimageinvivolocalizationoftumorvasculatureandtumorcellsatdifferenttimepoints.Micebearinglivercancer, aandmrycancerwerealsogiveni.v.injectionsof131I-RRLtoimagetumorsat24hrespectively.TheRRL-containingcyclicpeptidecomprisingtheRRLsequencebracketedbyglycinesandterminatedwithcysteineandtyrosineresidues(Tyr-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys),Reversed-phaseHPLCofthecrudeproductyieldedamainpeakcontainingmorethan99%oftheabsorbanceat220nm.ESI-MSoftheRRLpeptideshowedthatthemolecularweightwas1040.2beforeoxidationandwas1038.2afteroxidation.InthecontrolpeptideglycinesweresubstitutedfortheRRLsequence(Tyr-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys,GGG),Disulfidebondsbetweencysteinesoneachpeptidemaintainsthecyclicstructure.Theradiolabellingefficiencyof131IlabeledRRLpeptidewasabout69%,buttheradiochemicalpuritywasmorethan96%.Uptakeoftargeted131I-RRLandFITC-RRLweresignificantlyhigherinB16andHUVECcellsthanHK-2cells.Cellcountingkit-8demonstratedthatRRLhasnosignificantcytotoxicitytoHepG2cellscomparedwithPBSgroup.Thelivabilitywas100%(0μg/ml),99.7%(50μg/ml),98%(100μg/ml),97%(200μg/ml),95%(300μg/ml),89%(400μg/ml)respectively.ThelivabilityFITC-RRLwas100%(0μg/ml),94.1%(50μg/ml),91%(100μg/ml),89%(20056%(300μg/ml),44%(400μg/ml)andcistinwas91%(1μg/ml),36%(234%(3μg/ml),29%(4μg/ml),19%(5μg/ml),respectively.Thelivabilityof131I-was100%(0kBq),97.6(74kBq),93.9%(370kBq),58.6%(740kBq),38.7%kBq).Invivo,SPECTimagingshowedsignificantlyhigherconcentrationsofradioactivityintumortissuewhenusing131I-RRLimagemalignantmelanomaateachtimepoints.Tumorswereclearlyseenafterinjectionoftracerat24and48h,anduntil10daysitcouldstillbeseeingbySPECT.131I-RRLwasaneffectivemolecularimagingagenttovisualizelivercancerand abesidesprostatecancerbutnot rycancerintumorbearingmice.Thesedatesshowedthattumorendothelialcells-specificbindingpeptideRRLwasnotonlycaninctwithendothelialcellsbutalsocouldtargettotumorcellsspecifically.TargetedpeptideRRLmaythusofferanoninvasivetumorvascularandcellsimagingtechniqueforthefunctionaltumorimagingandhasfurtherimplicationsfortherapeutictumortargeting. ]Arginine-arginine-leucine;Peptide;Moleculartumorimaging;131I;Nudemicebearingtumor;Angiogenesis文献综是导致人类疾病的主要原因之一严重到人类的生命健康面，都存在极大的。一直以来，各国生命科学家和临床工作者都致力于恶性利用各种有效对肿瘤进行早发现、早诊断、早治疗的“三早”原则更是受到普遍重视。但是目前所应用的大多数检测，或缺乏特异性，或灵敏度较低，或在诊断探针上程序复杂、造价昂贵等，在临床实际应用中受到一定限制分子影像学是通过现代影像技术在上对致病分子过程疾病特征的异常(molecularMRI,mMRI)、磁波谱(magneticresonancespectroscopyoptical,MRS)生物发光显像(bioluminescenceimaging)(opticalfluorescenceimaging)、靶向超声成像(targetedultrasound),单光子发射计算机断层成像(singlephotonemissioncomputedtomography,SPECT)和正电子发射断层成像(positronemissiontomographyPET)[1]特别是核医学显像技术PET,通过使用深入疾病分在提高SPECT显像分辨率的基础上实现了分子生物学和分子医学检测目的,核医学可以将任何一项肿瘤分子生物学的成果开发为相应的肿瘤显像剂,完成与临床的无缝对接,克服了现有分子生物技术脱离内环境、体内复杂信号调控和不同组织细胞间相互作用的局限性,,肿瘤核医学(nuclearoncology)是核医学最重要的应用领域之一，是将分子生分子水平上认识肿瘤不同于正常组织细胞代谢的生物学特性,阐明靶或组因和抑癌的异常表达肿瘤组织细胞生物化学代谢的变化与细胞信号转导机),域作为最有效的辅助研究之一，提供分子水平上的相关有用信息,是世界医学领域研究的前沿、热点方向,是现代分子医学的追求目标[2]。义寡核苷酸分子探针进行显像的研究和siRNA分子显像的研究、肿瘤组织中针,即新型放射性药物的研发等[3]。人们对的研究曾经非常乐观的态度甚至将其作为一个计划制定出在几十年内要攻克这个科学难题但是科学的发展并不以人的包括肿瘤细胞活性改变细胞受体表达位置及数量的变化、信号通路的激活与失活等肿瘤生物学性质的改变重新认识，依据肿瘤组织不同于正常组织的生物学特性尝试各种可能的治疗方法或是现有治疗方法之间的互补融合分子功能影像技术作为可视化技术在肿瘤研究过图1肿瘤分子功能显像内容。来源于TRENDSinMolecularMedicine,2007,13。非侵入性分子功能影像技术的历史可以追溯到1895年WilhelmRoentgen发现X射线。而现代医学的发展要求在疾病的诊断及治疗中综合应用各种医疗设备，包括CT、MRI、PET、SPECT、超声显像及光学显像等技术，实现不同影像技术之间“取长补短”的目的，为临床提供有价值的信息。十年前，对于肿瘤的研究主要集中于活性改变在发生发展过程中的作用断有新的在肿瘤发生中的作用得到认识。现在，研究者逐渐将研究的视角转向肿瘤生长的生理微环境的作用实质细胞(包括肿瘤干细胞和肿瘤实质细胞)特殊的生物学性质的改变细胞外基质对肿瘤生长尤其是侵袭力及远处转移的作用；大量的分泌因子和细胞因子等对发生发展进程的作用、侵 目前绝大多数依赖临床中可用的非侵入性的影像。过去十，肿瘤影像技。，的影像学仪器设备的开发上市，有临床实用价值的新型显像探针的发展工踪特殊分子作用过示踪细胞和组织功能的分子影像学技术[6]。在未来十年，我们的工作重点是将越来越多的研究成果尽快转化为临床可应用的技术，，目前肿瘤诊断和治疗中遇到。生耐受导致治疗方案[7,8]正常细胞转化为细胞后最重要的特性就是无限增殖能力及自我更新能力使得发现较迟的几乎不能彻底治愈并对放化疗产生多药耐药不能治愈的关键是细胞向周围组织的侵润及向远处转移其中肿瘤新生血管的生成是产生侵袭力和维持远处转的分子机制的过程中发挥重要作用[10]的早期诊断无疑是最重要的，在肿瘤尚未向周围组织侵润及远处转移时就给予有效的治疗可以明显的降低的率[11]要实现的早期诊断必须要依靠研发高敏感性和高。一、肿瘤特异分子显肿瘤标志性特异分子功能显像是指用影像探测在肿瘤的信号通路调节显在内示踪导致发生的某些肿瘤相关表达活性的变化启动子的活性以及转录活性对于肿瘤研究非常重要目前已经的显像包括荧光素酶基因(luciferasegenes)[12]用于生物发光显像，荧光蛋白基(fluorescent-proteingenes)[13]用于荧光显像(fluorescenceimaging)，单纯疱疹胸苷激酶(herpessimplex thymidinekinase，HSVtkgenes)[14]用于核医学PET，SPECT显像铁蛋白(ferritingenes)[15]和chemicalexchangesaturationtransfer(CEST)reporters[16]用于MRI显像。表达显像有助于了解肿瘤发生发展过程中水平分子机制以及功能表达的改变，如示踪重要的癌myc，和抑癌P53改变的显像[17,18]在临床诊疗实践中发挥重要的作用。表达显像另一个重要的应用是检测治疗时体内载体的分布。癌myc与肝癌的密切。在转小鼠的生物发光显像中发现胞可以直接导症发生。据人类50%的均发生了p53的突变抑癌p53在细胞周期调节和凋亡中发挥重要的生物学功能生物发光显像能够评价p53基因的转录活性[7][0]85%PET动子片段的表达活性[0][9mT]标记小干扰N(iN)[1]。受体显肿瘤受体分子显像示踪细胞内过表达的标志性受体分子用于肿瘤预后的判断以及靶向治疗方案的制定和疗效评估。在多种细胞中HER-2/neuHER-2/neu受体的单克隆抗在的肿瘤模型动物中能够示踪HER-2/neu受体的表达变化[22]另外一个成功的应用于临床前及临床显像的受体是特异性膜抗原(prostate-specificmembraneantigen，PSMA)。检测雄激素依赖性癌和已经发生转移的前列的肿瘤实质细胞表面过表达的PSMA信息，可以作为癌显像和治疗非常有价值的靶点在临靶向结合PSA放射性核素标记的单克隆抗体，如111In标记的P(promabpndtide)已被床用于诊断癌。但是存在的P[3]。PSAPSA具有高亲和力的配体作为分子探针，放射性核素标记的显像剂[11]H3I用于PT显像或者[12I]NIIodogn标记用于SPET显像新型显像剂列动物模型中被广泛研究[4]PSAPSA细胞内抗原决定111InP更有优势[2]PAA的谷氨酸盐尿素赖氨酸IP1072,IP1095PSA谷氨酸羧肽酶的活性，被放射性核素123I标记后在表达PSA受体的inCp癌动物模型中SPET/T显像效果很好与受体有很强的亲和力作为新型放射性药物应用于癌的诊断和分期[5]。αvβ3是另外一个被作为抗肿瘤治疗靶点的受体，同时也是肿瘤分子表面[27]。αvβ3的抗体LM609MRI显像技术的肿瘤新生血管分[28]，近期研究证实一种糖基化环五肽[19F]Galacto-RGD(arginine-glycine。-asparticacid),可特异性结合于αvβ3受体，在肿瘤模型动物中和患者中，利用PET显像能够显示肿瘤新生血管[2426][19F]Galacto-RGDPET显像在探测肿瘤新生血管，制定诊疗计划和监测疗效方面有重要的应用价值一项研究利用高密度脂蛋白(highdensitylipoproteinHDL)与血管内皮细胞结合的特性改装其结构，与靶向结合于整合素αvβ3的RGD肽连接发现能被肿瘤血管内皮细胞大量的。可以特异性的与凋亡细胞表面表达的磷脂酰丝氨酸残基结合的膜连蛋白-V(annexin-V)是评价肿瘤细胞凋亡的经典显像剂。膜连蛋白-V的衍生物：在化疗药5氟尿嘧啶(5-FU)诱导凋亡的细胞中结合量增加[33。[124I]SIB-annexinV是值得深入研究的化疗诱导凋亡的PET凋亡显像剂[33]。多药耐药显多药耐药(multidrug,MDR)是化疗失败的主要原因之一。核素标记的小分子有机化合物和金属复合物作为Pgp转运基质，通过PET和SPECT显像，能够显示患者组织中Pgp的表达变化[34]。已经被批准临床使用的两个分子功能显像剂99mTc-sestamibi和99mTc-tetrofosmin,可以在体评价人类肿瘤组织中Pgp介导的药物转运活性变化[34]，监测化疗过程中MDR的发生情况。导致MDR产生的还包括多药耐药蛋白1(multidrug-resistantprotein1,及其类似物(MRP2-6),抵抗蛋白(breast protein,BCRP)目前用于标记MDR探针的放射性核素主要包括99mTc67Ga64Cu11C18F等[35]。细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在的发生及进展过程中蛋白酶显测，从而示踪酶的活性的变化。这种方法已经被用于基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase,MMP-2)的探测[41。细胞通透蛋白(activatablecell-penetratingpeptides,ACPPs)是研究的有效的体内蛋白酶活性显像分子探针多聚阳离子肽的细胞能力常常被多聚阴离子的静电作用所阻断蛋白质水解酶能够打开二者相互作用的结构释放多聚阳离子进入细胞内放射性核素177Lu标记MMP-2/9的ACPPs，生物分布实验发现其在肿瘤中的分布是肌肉组织中的5倍多。是有前景的肿瘤表达蛋白MMP-2/9分子探针[42]。溶酶体是有多种蛋白酶的细44]，非侵入性的光学显像方法应用特异性浓聚于溶酶体蛋白的6-O’-葡萄糖胺标记的荧光探针，在动物模型中示踪溶酶体的表达[44]。二、新生血管生成，乏氧及代谢分子功能显血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表达，同时激活其肿瘤血管系统的动态功能显像的目的，CTMR显像以及SPECT和PET显像。而靶向肿瘤新生血管的显像主要是以肿瘤内皮细胞表面特异表达的VEGFRMMP及整合素受体为靶点[47]。[48]的代谢特点还表现为缺氧依赖的糖酵解活性增强，有氧代谢的三羧。乏氧分子功能显。都受益氧的分子功能显像技术[51]。18F-氟米索硝唑(18F-misonidazole, MISO)是PET显像应用的乏氧显像剂在细胞水平动物水平及内，18F-MISO都可以选择性的浓聚于缺氧组织区域内癌动物模型中，采用缺氧反应因子调控稳定表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的细胞，探测其荧光达，组织对近红外光谱(700～1000nm)的吸收也能够用来在体探测血液中氧气饱和度[53]，监测组织乏氧状态。缺氧诱导因子1(hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1)在发生发展中和放疗抵抗的病理生理过程中均起着重要的作用，有研究者设计融合蛋白(PTD-ODD-SAV[POS])，即蛋白转导结构域(proteintransduction,PTD),链霉素(streptavidin,SAV)以及HIF-1α的氧依赖性降解结构域(oxygen-dependentdegradation,ODD)蛋白三者的融合。被(3-123/125Iiodobenzoyl)norbiotinamide(123/125I-IBB)标记后成为123/125I-IPOS新型乏氧。18F标记氟代脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18FDG)作为PET显像剂，萄糖代谢活性成正比。18F-FDGPET分子功能显像是临床肿瘤诊断和分期的标准方法[55]PET/CT(standarduptakevalue,SUV)值实现间接PET定量。，，由于肿瘤组织葡萄糖代谢活性增高，有研究者采用氢[1H]标记的磁波谱显像方法探测乳酸代谢示踪肿瘤组织的代谢状态另外[11C]和或氟18F]标记的胆碱用于PET显像，探测内生性的总胆碱数量的变化也是研究的热点之一。目前胆碱分子功能显像已经作为诊断脑内原位癌及的辅助诊断[56]。但是18F-FDGPET显像应用的局限性在于某些列和其他[57]显示出探测肿瘤临床应用的优势。，，小织的分子反应过功能改变可视化示踪分子信息改变的能力以及理解肿瘤早期生物学特性的分子功能显像提供了新的视角去探索肿瘤组织重要的分子过程研发抗癌药物及治疗的缓释系统，以及影像技术引导下iNA治疗肿瘤的技术，并实时监测疗效，从而使治疗有的放矢。是将分子功能显像推广为临床的方法以示踪的特殊的生物学围，人们发现距离血管0.2mm之外的肿瘤细胞将不再增殖，而更远处的肿瘤细胞则会[57]。肿瘤血管新生是肿瘤维持生长不可缺少的必要条件，通过Folkman[59]首次提出肿瘤依赖血管生成(angiogenesis)理论，血管生成及抗血管生成治疗很快成为在分子与水平研究各种肿瘤生物学性质及抗肿瘤治疗Weisseleder[60]于1992首次提出分子影像学(molecularimaging,MI)的概科的发展及研究的不断更新，肿瘤血管生成显像及影像技术引导下抗血管肿瘤血管生、血管生成现象并非肿瘤生长所特有，它实际上是血管新生(neovascularization)的表现形式之一,后者还包括早期胚胎发育中由内皮前体细胞形成原始血(vasculogenesis)与缺血状态下心脏侧枝血管形成及改建(arteriogenesis)的过程。因此，血管生成既可见于如伤口愈合、女性生殖周期、怀孕等诸多生理过程，又存在于如肿瘤、类风湿性视网膜病变等许多病理过程中[61]。出芽(sproutin)生长是目前已知最经典的肿瘤血管生成方式，其过、者发现除了出芽方式，尚有其他机制参与肿瘤血管生成，如套叠式生成、血管生成拟态的作用即(vasculogenesis)[64]和镶嵌体血管(mosaicbloodvessels)[65]等。皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是目前已知促新生血管生成过程中扮演了的角色因此阻断二者的作用途径是抑制肿瘤血管生的重要策略之一肿瘤新生血管的生物学特由于组织生长速度很快通过弥散作用从周围血液循环不能得到足血管生成因子刺激的敏感性增加，在以基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,组织的血管。肿瘤新生血管具有以下特点[68,69]：3透性比正常毛细血管高10倍，但肿瘤中多数渗漏似乎是由于肿瘤中VEGF生成(angiogenin)等。而血管生成的“开关”则取决于促血管生成因子和血管生成抑新生血管生成介导肿瘤的侵润和转肿瘤新生血管显像方法及分子靶向显像性和真实性。②存在各种生理屏障，分子探针必须具备穿越这些屏障到达相容性和稳定性，能参与正常生理代谢过程，安全、无毒副作用等特点。一、VEGF受体D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子(centalgrowthfactor,PLGF)，包含有VEGF共同结构域[72,73]。VEGF受体的成员包括VEGFR-1(Flt-1/FLT-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3(Flt-4)、neuropilin(NPR1/NPR2)。VEGF主要结合在两类酪氨酸激酶受体上(VEGFR-1VEGFR-2)，其介导的血管生成活性主要受这两个受体数量和活性的调节[74]7个免疫球蛋白结构域的胞外区、一个跨膜区和一个酪氨酸激酶序列的胞内区三部分。VEGF除了与酪氨酸激酶受体结合外，还可以与neuropilin(NPR1/NPR2)受体结合。VEGFR-1是最早VEGF(RTK)型受体，在血管生成时具有双重功能，在不同的细胞和不同的生长阶段可能介导VEGF的正性和负性信号转导[75,76]，VEGFR-2VEGF促有丝呈现过表达状态常常是预后不好的分子标志[73]。VEGFR-3VEGF-C、VEGF-D的受体，可引起内皮细胞的增值和迁移，调节淋巴管和血管内皮细其受体结合的化合物[78]VEGFR-2作用的抗体[78,79]VEGFR-2激酶VEGF/VEGFR级联放大信号通路[80-82]新生血管治疗的主要研究方向。人源化的抗-VEGF单克隆抗体贝伐单抗(avastin;genentech)已经作为治疗的一线药物这充分肯定了VEGF/VEGFR信号通路在发生发展中的重要作用[83–85]。射性核素包括123I,铟[111In99mTc,铜[64Cu],锆89Zr]VEGF121和VEGF165是包含[3]E在癌和转移灶中的成像方法,有研究者研究了12IVEGF15和13IVEGF21在HVE，几种不同组织来源的肿瘤实质细胞，以及不同来源的人原位肿瘤中EEF受体[9]13IVEGF65[0]123IVEG165显像能够区分病和转移病灶在另外一项包含了9个胰患者的研究中评价了123IVEGF65生物分布体内应用安全性和辐射吸收剂量91。尽管绝大多数胰的灶及转移灶能够被13IVEGF16显像方123IVEG165/（trgt/nontargt,T/NT[92]。近年，15IVEGF21和15IVEGF15多用于生物分布和放射自显像的研究[3]胃里大量显像剂的残留是13IVEGF65显像肿瘤新生血管的主要。有意思的125IVEGF11VEGFR在体积较小的肿瘤组织中比体积较大的肿瘤表达量高。同时发现在某些中如肾、心脏和肺脏中，125IVEGF165125IVEG121的摄取，但在其他一些中125IVEG165的摄取又偏[3]具体机制目前还不清楚除了被放射性VEGF12199mTc[49]99TVEGF121已被用于不同方案化疗前及化疗后，肿瘤血管显像技术[6]。将VEF15通过柔性多肽链(GGS)3连接于人转铁蛋白的氨基末端hnTfVEGF)，用于肿瘤新生血管显像[7]65和30k111InhnTfVEGF能够显像U87G人恶性胶质细胞瘤，注射显像剂后72h肿瘤组织对显像剂的摄取率为6.7%ID/g。用100倍显像剂量的VEGF预先饱和受体后，肿瘤组织对111In-VEGF的摄取降低[98]体显像为临床抗血管生成治疗方案选择治疗时机选择以及更好的监测,的结合人VEGF124I标记后作为PET显像剂，在免疫缺陷小鼠的抗体HuMV833,已经进入I期临床试验[102]。侵袭性实体患者用不同剂量的HuMV833预处理后，124I-HuMV833PET显像示踪其体内生物学分布及组织清图1VEGFR表达SPECT显像。A为胰横断面成像(左侧：CT，右侧：SPECT)；B为生物发光成像（左侧：D荧光素，右侧：99mTc-VEGF121）；C图为注射111In-hnTf-VEGF48h后性，甚至同一个患者也不同。在最近的研究中贝伐单抗被放射性核素111In、标记，用于SPECT和PET显像[104]。9只SKOV-3人癌移植瘤模型鼠注射89Zr-bevacizumab,111In-bevacizumab,及89Zr-IgG24h后PET显像发现显像剂被血流灌注丰富的组织大量摄取，72h后可见肿瘤部位清晰的图像。(图2)。图289Zr-bevacizumab在癌模型中不同时间点显像肿瘤血管VEGFR于VEGFR高表达阶段或者是高表达VEGFR的肿瘤组织中。在治疗开始前进行二、整合整合素(integrin)是一类细胞粘附受体蛋白，是由α和β两个亚基通过非共价键结合而成的异二聚体跨膜糖蛋白[105-107],主要介导细胞与细胞和细胞与亚基均为I胞粘附作用[108]18α8β进向远处转移，增加肿瘤对周围组织的侵袭力。图3整合素，24种受体亚型。JNuclMed，2008;(fibronectin,Fn),层(laminin,Ln)(vitronectin,Vn)等。整合素与配体的结αvβ3是所有整合素中研究最多的受体，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arginine-Glycine-Asparticacid,RGD)αvβ3受体靶向特异结合[109,110]αvβ3既表达于肿瘤血管内皮细胞的表αvβ3受体表达异常可使肿瘤细胞和内皮细胞持续增生[111]αvβ3整合素受体表达较低。目前，整合素单克隆抗体、RGDαvβ3的多肽显像剂已经被用于肿瘤2080RGDRGD肽的结构进行修饰并研究其对整合素受体的生物学作用，经过大量的实验研究发现RGDαvβ3[113,114]的深入，RGD肽的应用逐渐成熟化，应用磁性颗粒，放射性核素或荧光标意义[115,116]125I,99mTc,111In18FRGD肽，在体实验显示RGD标记分子探针具有良好的体内稳定性和较快的血液清除能力[117,118]αvβ3111In标记全氟碳化合物纳米颗粒探测新西兰大白兔体内移植Vx-2肺肿瘤的新生血管[119]，10111In1111In原子的纳米颗粒的肿瘤/肌肉摄取比高，注射显像剂18hαvβ3的纳米颗粒的放射性计数是对照颗粒的4倍多。单壁碳纳米管(single-wallcarbonnanotubes,SWNTs)基于其颗粒大小、形状及物理特性，在生物应用方面表现出卓越的优势[120,121]64Cu标记SWNTs，研究其体内分布、肿瘤PET显像效果及体外光谱学(ramanspectroscopy)[122]，发现聚乙二醇化的SWNTs有较长的生物半衰期，网状内皮系统(reticuloendothelialsystem,RES)摄取较少。小鼠整合素αvβ3表达阳性的U87MG神经胶质瘤肿瘤组织对SWNTs的摄取可以达到(～15%ID/g)，是目前的纳米颗粒作为显像剂的最高摄取率同时也能够实现与RGD多肽的连接(图4)。在组织匀浆分析中没有观察到明显的肾脏摄取。尽PET64CuSWNTs脱标而被肾脏组织摄取有少70kDa（纳米级）的化合物多通过肾脏清除[125,126]。除放射性核素标记RGD外，应用于分子磁显像(mMRI)Gd3+-连接脂和全氟碳化合物纳米颗粒，超小顺磁性氧化铁纳米颗粒(ultrasmallsuperparamagneticironoxide,SPIO)也被广泛研究。RGD肽作为肿瘤新生血管分子显像剂存在的主要尚待进一步解决的问题是如何提高RGD减少肝、肾放射性等。αvβ3knottin组装于全氟化碳像[127]4靶向结合整合素αvβ3SWNTs显像。(A)SWNTs模式图，蓝色片段为结合于SWNTs壁的磷脂，聚乙二醇（polyethyleneglycolPEG）链增加水溶性，DOTA分子是64Cu的螯合剂。(B)二维小动物PETRGDRGD-SWNTs成像。(C)组织匀浆光谱分析，证实了SWNTs在肿瘤组织中的存在。(D)RGD-SWNTs体内分布。引自参考文献(122).三、新型肿瘤新生血管显像剂RRL小分子多2000年，Brown等[128]应用他们自己开发的FliTrx大肠杆菌肽展示文库寻找(tumorderivedendothelialcell,TDEC)特异性表面标志物5个与TDEC5TDEC(NIH3T3)的体外结合实验，NIH3T3作为对照细胞，除了多聚赖氨酸序列外，所有肽显示出相同的背景结合(图5所示)。异硫酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标的精氨酸-精氨酸-(Arg-Arg-Leu,RRL)序列显示出最强的荧光信号，提RRL与TDEC6所示图5.不同多肽序列与成纤维细胞(NIH3T3)体外结合实验。来源于AnnalsofSurgical图6.不同多肽序列与肿瘤来源内皮细胞(TDEC)体外结合实验。来源于AnnalsofSurgicalOncology,2000,7(10):743-749Weller等[129](microbubble,MBRRLTDECMB-RRL在TDEC3～6(P＜0.01)(见7)。（P＜0.0165(2):533-8.FITCRRL多肽序列体内肿瘤血管结合情况。箭头所指为血管腔。CancerResearch,2005,65(2):533-539.RRL通过尾静脉注射入荷PC3CloneC肿瘤的无胸腺小鼠体内，5h后处死小鼠，用生理盐水冲洗其血管，取肿瘤组织，冷冻切片，荧光定CloneCRRL定位于内皮层以及其区域。PC3肿瘤血管较少，荧光标记的RRL大多位于内皮表层。对照肽(Tyr-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys,GGG)在任何一种肿瘤内无(见图11只荷瘤鼠通过尾静脉注射MB-RRL及MB连接的对照肽GGG，时控MB-RRL超声显像能够在体显示肿瘤新生RRL显像肿瘤新生血管的可行性，并预估了进一步靶向血管治疗可能性(见图9)。图9.RRL多肽体内靶向超声显像。来源于CancerResearch,2005,65(2):533-有研究表明，RRL多肽序列特异性的结合于人癌组织，存在肿瘤显像的可能性。Alexa680，800是2种近红外，将RRL多肽序列与Alexa连接，通过静脉注射入PC3癌鼠模型动物体内，可以使肿瘤组织特异性的发出荧光信号，而其他部位组织未显像[130]。RRL结构的氨基端添加一个酪氨酸，设计合成能够被放射性核素碘标记的RRL,使其结构变为Tyr-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys，此结构已申请专利。RRL99%以上(10)。10.RRLHPLC氯胺-T法碘[131I]RRL20℃，pH7.42min条件下可获得较高标记率，达到60%以上，最佳的RRL多肽/氯胺-T质量比为1：1.80。纯化后其放射化学纯度大于95%。核素标记的RRL在体内外稳定性好，在37℃人新鲜24h90%(11)。图11.131I-RRL体外稳定性结果。来源于JLabelCompd 2008,51(11):374-378.131I-RRL与131I标记的对照肽GGG分别注射入癌荷瘤鼠体内，进度明显下降24h后，肿瘤组织131I-RRL的摄取为(0.65+0.12%)ID/g(1)，而对照肽的摄取仅为(0.06+0.04%)ID/g(2)。表1.131I-RRL体内生物学分布。引自JLabelCompd 2008,51(11):374-378.表2.131I-GGG体内生物学分布。引自JLabelCompd 2008,51(11):374-378.尾静脉注射131I-RRL和131I-GGG在24h分别进行SPECT动物显像，于证实131I-RRL对癌的模型鼠有肯定的显像效果[131](见图12)2010年，Yu等[132]131IRRL在肿瘤显像中的肯定效果。12.131I-GGG(a)131I-RRL(b)24hSPECTJLabelCompdRadiopharm,2008,51(11):374-378.RRL对肿瘤新生血管的显像效果是肯定的，但是RRL如何示踪肿瘤新生血管、其与肿瘤新生血管内皮细胞特异性结合的作RRLTDEC结合的作用机制还属未知。于是我们进行了RRL显像机制的预实验研究，用计算机模拟软件进行结构对接发现RRL结构与VFGFR-2的结构可以实现能量对接。所以我们初步假设小分子肽RRL可能与TDECVEGFR-2受体亚型特异性结合。小结与展可以预见，抗肿瘤血管生成的介入治疗以及对抗肿瘤血管生成疗效的分子MassoudTF,GambhirSS.Molecularimaginginlivingsubjects:seeingfundamentalbiologicalprocessesinanewlight.GenesDev,2003,17:545–580.:王荣福.核医学 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