维氏气单胞菌TH0426株fis基因的克隆及生物信息学分析

III1前言维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）是近年来新发现的革兰氏阴性菌，在自然界中普遍存在，是感染人兽及水生动物的一种重要病原菌。该菌普遍存在于淡水、污水，土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生态环境中正常存在的，也有一些菌株具有致病性，主要感染变温动物，如中华绒螯蟹、泥鳅、锦鲤，斑点叉尾鲴等，会引起大量死亡；近年来，国内维氏气单胞菌引发的水产疾病呈上升趋势，如泥鳅[1]、乌鳢[2]及鲶[3]等因感染维氏气单胞菌而出现腹水或出血等症状，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。此外，维氏气单胞菌还能通过水源、伤口感染等途径进行传播，引起人类的肠胃炎、食物中毒等[4]。维氏气单胞菌对恒温动物是一种机会致病菌，但有人认为免疫功能健全者也可被感染，通常患者发生急性腹泻，也可能引起菌血症、脑膜炎和心内膜炎等[5-6]。近目前，A．veronii在食品安全上也表现出重要的意义，研究表明污染的畜禽肉类、水产品和蔬菜等均是A．veronii的重要传染源，因此一些国家已把A．veronii及其同属菌作为水体质量和食品安全的检疫对象[7-9]；当前，人们也逐渐认识到水产品质量安全以及水体环境污染等问题的重要性，细菌的流行与暴发也同样困扰着水产养殖人员[10]。此外，许多大型水产养殖场也被A．veronii破坏,随着对A．veronii的了解越来越多，大量抗生素的投入使细菌的耐药性不断增加,尤其重要的是研究A．veronii的致病过程，可以有效帮助人们根据症状制定有针对性的治疗方案。因此，研究细菌的毒力基因作为揭示细菌致病机制的重要手段，为开发新型疫苗并解决水产相关问题提供了新方向[10]。fis基因为Ⅵ型分泌系统AAA+家族ATP酶，其家族其他成员参与多种细胞过程。Neuwald[11]等人基于仔细的和多个序列比对，于1999年提出了包括经典AAA家族的更广泛的AAA+家族，之后进一步发现AAA+家族蛋白质通常执行类似伴侣的功能，有助于蛋白质复合物的组装，操作或拆卸。Teru等人探究了AAA+家族蛋白的结构，发现该家族蛋白质特征：有结构保守性的是约250个氨基酸的中央ATPase结构域（称为AAA+模块）。Nahar等[12]人发现AAA家族蛋白Cdc48-Ubx2复合物通过调节底物的泛素化状态来调节线粒体外膜蛋白Fzo1转化。Li[13]等人发现AAA+ATP酶TER94可以与杆状病毒早期蛋白LEF3和解旋酶相互作用，以转运并进一步募集与病毒复制相关的蛋白以建立病毒复制工厂。Khong[14]等人发现AAA家族ATPasep97/VCP的丧失导致nockdown细胞的肌动蛋白动力学降低，细胞运动性受损，RhoA蛋白水平升高，参与了蛋白酶体依赖性蛋白降解途径。而AAA+家族ATP酶fis基因在A.veronii中未见报道。相信通过了解基因在A.veronii的作用将会对我们探究其致病机制有所帮助。国内研究A.veronii的科研人员不断增多，但是大多数为分离鉴定菌株，药敏试验以及常规的理化分析，关于致病机制的报道不是很多，深入探究基因功能的报道也是更为稀少[27]。本实验通过克隆fis基因片段及进行生物学分析，来研究其功能和特征，为进一步揭示致病机理提供帮助，从而可以实变fis基因降低维氏气单胞菌致病性的理想，为制备维氏气单胞菌基因工程疫苗奠定基础。2材料2.1菌株及质粒载体A.veroniiTH0426菌株由本实验室保存；大肠杆菌感受态TransT1菌株均由笔者所在实验室保存。pEASY-BluntZeroCloningKit质粒购自北京全式金生物技术有限公司。2.2实验主要试剂购自宝生物工程(大连)有限公司的T4DNA连接酶、DNAMarker、细菌DNA提取试剂盒、PBS缓冲液、DNA凝胶回收试剂盒、克隆载体pMD18-T；购自北京全式金生物技术公司的广谱蛋白Marker、预染彩虹蛋白Marker；购自康为世纪生物科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒2.3实验主要仪器购自苏州净化设备的超净工作台；购自德国Eppendorf公司的移液器，梯度PCR仪；购自杭州博日科技公司的恒温金属浴；购自上海跃进医疗公司的恒温培养箱；购自金坛新宝仪器公司的恒温摇床；购自上海菁华科技仪器公司的分光光度计；购自日本Panasonic公司的-40°C冰箱与高压灭菌器；购自美国应用生物系统公司的实时荧光定量PCR仪；购自美国Thermo公司的酶标仪及核酸分析仪；购自德国Sigma公司的低温高速离心机。3.方法3.1引物的合成查阅相关文献得知维氏气单胞菌TH0426全基因组序列，fis基因的序列从基因库中获得，利用Primer5.0软件设计一对特异性引物，上游引物P1:ATGGAGCAAGCCCTCGCAT，下游引物P2:TCAGTTCACCTCCAGTTTCTGA。由吉林省库美生物科技有限公司合成引物，而实时荧光定量PCR引物由宝生物工程（大连）公司负责设计合成。3.2fis基因的扩增先对实验室保藏的A.veroniiTH0426进行活化，之后通过划线将菌株的菌液接种于RS平板上，在30℃培养24h，挑取单菌落于LB培养基中接种，在28°C培养24h，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，详细步骤请参见试剂盒说明书。以提取的DNA为模板，利用PCR技术扩增fis基因。反应条件为：首先在94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；之后在72℃再延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR扩增产物，以保证DNA的完整性。3.3目的基因的序列分析及系统进化树构建将测序结果应用BLAST检索工具进行序列同源性分析，与已知维氏气单胞菌的fis基因序列进行比对。应用MEGA5.0软件根据比对结果构建克隆得到的fis基因的系统发育树。3.4目的基因编码产物的生物信息学分析在应用Editseq翻译出fis基因编码的氨基酸序列后，利用生物信息学分析软件进行分析。用ProtParam预测该编码产物的基本理化性质，用Protscale分析Fis蛋白的疏水性，用singalPv3.0分析Fis蛋白的信号肽，用TMHMMv2.0分析Fis蛋白的跨膜区，用SMART对Fis蛋白的结构域进行分析，用PORTER分析Fis蛋白的二级结构，用SWISSMODEL预测Fis蛋白的三级结构，Protean预测Fis蛋白的B淋巴细胞抗原表位，SYFPEITHI预测Fis蛋白的T淋巴细胞抗原表位。3.5重组pEASY－fis克隆质粒的构建将PCR扩增的目的条带进行琼脂糖凝胶电泳，按DNA凝胶回收试剂盒的说明书回收目的基因片段，并将其与克隆载体pEASY连接，构建组质粒pEASY－fis。将重组质粒pEASY－fis转化入大肠杆菌感受态TransT1中。疑似菌落经PCR和双酶切鉴定后，由库美生物科技有限公司测序鉴定。4.结果4.1黄颡鱼源维氏气单胞菌fis基因的提取根据基因组DNA电泳的结果，我们可以看到DNA条带的亮度较高，这证明了本实验提取的DNA含量较高，拖尾现象较轻，说明部分DNA可能被降解了，但是降解程度不大，DNA的完整性保存较好。图4-1：维氏气单胞菌TH0426fis基因提取结果Fig.4-1：ExtractionoffisgenefromAeromonasvickersTH04264.2维氏气单胞菌TH0426Fis基因PCR扩增结果以黄颡鱼A.veroniiTH0426菌株基因组为模板，PCR扩增fis基因，获得约1539bp的基因片段，该片段与目的基因大小及原基因序列比对一致。图4-1：维氏气单胞菌TH0426fis基因PCR扩增结果Fig.4-1：fisgenesPCRproductsfromisolateTH04264.3fis基因系统进化树的构建根据A.veroniiTH0426fis基因核苷酸序列与GeneBank中已报道的气单胞菌的fis基因核苷酸序列进行同源性比对发现，分离株序列与GeneBank中已报道的A.veronii序列分属同一分支。如图所示：图4-3：fis基因的系统进化树构建Fig4-3：Phylogenetictreebasedonfisgenessequences4.4生物信息学分析4.4.1Fis蛋白质的理化性质分析用ProtParam工具对Fis蛋白质的理化性质进行分析。结果显示，Fis蛋白的氨基酸数目为512个,原子组成为C2516H4016N752O734S21，分子量：57217.42，理论等电点为pI:6.88，亲水性的平均值（GRAVY）为-0.288，不稳定指数计算为41.74，脂肪指数为94.39，这种分类的蛋白质不稳定。在组成Fis蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例达到14.5％，是占比最高的氨基酸,占比最多的其次是丙氨酸（Ala）,所占比例为10.7%，精氨酸（Arg）占比7.8%，谷氨酰胺（Gln）和甘氨酸（Gly）均占比为7.6%，谷氨酸（Glu）占比6.8%，缬氨酸（Val）占比5.5%，天冬氨酸（Asp）占比5.1%，丝氨酸(Ser)、组氨酸（His）、赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)含量较少，分别为4.5%、4.1%、3.7%、3.5%、3.1%，含量最少的是天冬酰胺（Asn）、异亮氨酸（Ile）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp），含量分别为2.9%、2.9%、2.5%、2.3%、1.8%、1.8%、1.0%。带负电荷的残基总数(Asp+Glu)：61，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）：59。所考虑的序列的N末端是M（Met）。哺乳动物网织红细胞的半衰期在体外估计为30小时，在酵母中超过20小时，在大肠杆菌中超过10小时。4.4.2Fis蛋白的疏水性分析应用ProtScale进行疏水性分析，分析表明，Fis蛋白是一种典型的疏水蛋白。图4-3：Fis蛋白的疏水性分析Fig.4-3：HydrophobicanalysisofFisproteinsequences4.4.3Fis蛋白基因编码蛋白的信号肽与跨膜区分析信号肽分析采用Singalp3.0，结果表明。基于神经网络算法，s平均值(means—score)小于0.5，不存在信号肽，整个编码序列可完全用于原核表达；基于HMM算法的预测结果可知，Fis蛋白存在信号肽的可能性为0.773，最可能剪接位点在30~31的概率为0.345；利用TMHMM2.0进行跨膜区分析，预测结果显示，Fis蛋白的1~512位氨基酸全部位于细胞膜的表面，不存在跨膜区，这与Fis蛋白疏水区分析结果基本一致。初步推测Fis蛋白可能与细胞信号转导有关。图4-4-3：Fis蛋白的信号肽与跨膜区分析Fig.4-4-3：SignalpeptideandtransmembraneregionanalysisofFisproteinsequences4.4.4Fis蛋白的结构域分析用SMART对Fis蛋白的结构域进行分析发现，目的蛋白在221—359位氨基酸残基存在一段高度保守序列。图4:4:4Fis蛋白的结构域分析Fig：4:4:4domainanalysisofFisprotein4.4.5Fis蛋白的二级结构预测经PORTER对Fis蛋白二级结构预测，结果显示，在该蛋白的二级结构中α—螺旋占比55.08％、β－折叠占比9.38％、β—转角占比5.08％及无规则卷曲占比30.47％。由此可推测，α－螺旋是Fis蛋白最多的二级结构元件。图4:4:5长竖线，α－螺旋；中长竖线，β－折叠；中短竖线，β－转角；短竖线，无规则卷曲Fig4:4:5Thelongverticallinerepresentsanalphahelix;Themiddleandlongverticallinesrepresentβ-folds;Themiddleandshortverticallinesrepresenttheβ-angle;Shortverticallinesrepresentrandomcurls4.4.6Fis蛋白的三级结构预测采用SWISS-MODEL同源建模方法预测了Fis蛋白的三级结构。结果表明，Fis蛋白的三级结构成分是基于6iy8.1的A链构建的，其一致性达到44.37%。图4:4:6Fis蛋白的三级结构预测Fig4:4:6PredictionoftertiarystructureofFISprotein4.4.7Fis蛋白B淋巴细胞抗原表位的预测图4:4:7Fis蛋白B淋巴细胞抗原表位预测Fig4:4:7PredictionofBlymphocyteepitopeofFISprotein4.4.8Fis蛋白T淋巴细胞抗原表位的预测经SYFPEITHI对Fis蛋白T淋巴细胞抗原表位分析预测，结果显示，4个抗原多肽为优势抗原，分别为GLLLGMLDV、AARPELASL、AMQAKLLRV、SLNIPKRTL。表4-4-8Fis蛋白T淋巴细胞抗原表位预测Tab.4-4-8PredictionofTlymphocyteepitopeofFISprotein5讨论维氏气单胞菌（A.veronii）是一种重要的人－兽－水生生物共患病原菌，近年来，A.veronii感染鱼类的报道逐年增多，给水产养殖业造成严重的经济损失。[30-33]夏秋两季，该菌有爆发趋势，尤其在我国南方地区，可导致人类和其他哺乳动物感染，以腹膜炎和胃肠炎为主要疾病。维氏气单胞菌（A.veronii）作为近几年发现的最常见的致病菌，常导致水生动物生病死亡，随之影响鱼类养殖业生产力，造成巨大的经济损失，已成为一个不容忽视的重要问题。A.veronii感染的早期治疗以抗生素为主，这将加剧抗生素残留和多药耐药菌株的产生，接种疫苗是预防鱼类细菌性疾病的理想措施。然而，关于维氏气单胞菌疫苗的研究很少，市场上也没有高质量的产品。因此，研发新型的气单胞菌候选疫苗对水产养殖业具有重要意义。A.veronii所携带的毒力因子与其发病机制密切相关，如脂多糖（LPS），外膜蛋白，气溶素，肠毒素等[40]。AAA+家族的ATP酶在所有活生物体中都存在，各种细胞过程都有它们的参与，包括膜融合，蛋白水解和DNA复制。许多AAA+蛋白质与AAA蛋白质参与相似的过程（促进蛋白质折叠和展开，蛋白质复合物的组装或拆卸，蛋白质运输和降解），但其他一些蛋白质在复制，重组，修复和转录中起作用[34-36]。AAA+家族的ATP酶的编码基因为fis基因，因此该基因可能影响蛋白的编码，进而对细菌的致病性和毒力有关[50]。试验以黄颡鱼源A.veroniiTH0426菌株的基因组为模板，成功克隆出A.veroniiTH0426菌株ATP酶的fis基因片段，通过生物信息学分析该基因，得知，Fis蛋白是典型的疏水性蛋白，且发现Fis蛋白无跨膜区，所有氨基酸均位于细胞膜表面。对Fis蛋白的二级结构进行预测，并以同源建模的方法，预测了Fis蛋白的三级结构，其结果为进一步研究Fis蛋白的结构与功能的关系提有重要意义。利用相应生物信息学软件对Fis蛋白的理化性质进行分析，其结果对相关的实验工作中具有重要参考价值。对Fis蛋白分子结构分析，应用ProtScale进行疏水性分析，结果表明Fis蛋白为一个典型的疏水性蛋白。使用singalP3.0进行信号肽分析，基于神经网络算法，s平均值(means—score)小于0.5，不存在信号肽，整个编码序列可完全用于原核表达；基于HMM算法的预测结果可知，Fis蛋白存在信号肽的可能性为0.773，位于30~31位最可能剪切位点的可能性为0.345；利用TMHMM2.0进行跨膜区分析，预测结果显示，Fis蛋白的1~512位氨基酸全部位于细胞膜的表面，不存在跨膜区与该蛋白质的疏水性区域分析结果基本一致。对Fis蛋白的二级结构进行预测，在该蛋白的二级结构中α—螺旋、β－折叠、β—转角和无规则卷曲分别占55.08％、9.38％、5.08％和30.47％。预测了Fis白的三级结构，其结果对进一步研究Fis蛋白的结构与功能的关系具有重要意义。当前，人们逐渐认识到水产品质量安全以及水体环境污染等问题的重要性，细菌的流行与暴发也同样困扰着水产养殖人员。因此，研究细菌的毒力基因是揭示细菌致病机制的重要手段。也为开发新型疫苗并解决水产相关问题提供了新方向。虽然本试验对fis基因有了初步的了解，但目前对fis基因功能尚无透彻的研究，其是否可以作为基因工程疫苗的一种候选抗原仍需进一步探究，本试验结果为深入研究fis基因的功能、免疫调节作用机制以及基因工程亚单位疫苗等奠定了基础。6结论（1）成功克隆了A.veroniiTH0426的fis基因。进行同源性比对构建系统进化树。（2）通过生物信息学分析，了解了Fis蛋白的相关信息。Fis蛋白的氨基酸数目为512个,原子组成为C2516H4016N752O734S21，分子量：57217.42，理论等电点为pI:6.88，亲水性的平均值（GRAVY）为-0.288，不稳定指数计算为41.74，脂肪指数为94.39，这种分类的蛋白质不稳定。在组成Fis蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，达到14.5％。Fis蛋白为一个典型的疏水性蛋白，并进行了T淋巴细胞抗原表位预测分析，有4条抗原多肽得分较高可作为优势抗原。

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