小吞噬实验的学习课件

小吞噬实验的学习课件第1页/共16页二、目的与要求1.了解中性粒细胞生物学特性及其意义。2.熟悉“细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能”试验的原理、方法及用途。

第2页/共16页[实验原理]中性粒细胞——来源于骨髓造血干细胞；占白细胞总数的60%~70%；生命周期短，不能分裂，靠“造血”补充；胞核呈多叶状；胞质内有多种颗粒；内含髓过氧化物酶、防御素、溶菌酶、组织蛋白酶、乳铁蛋白、碱性磷酸酶等。中性粒细胞特有，巨噬细胞没有这种酶，为中性粒细胞在细胞化学上的标志。第3页/共16页中性粒细胞通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物；中性粒细胞产生伪足包围异物——吞噬体或吞噬泡；吞噬——呼吸爆发——产生大量过氧化物及超氧化物等毒性效应分子——杀死吞噬的细菌等异物；第4页/共16页中性粒细胞：A.在抗化脓性细菌感染中起重要防御作用；B.引起感染部位急性炎症反应；C.参与超敏反应（如III型超敏反应），引起机体免疫病理损伤。第5页/共16页将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片染色，即能观察到被吞噬到中性粒细胞内但还未被消化掉的细菌。检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅助判断机体非特异性免疫力的指标之一。细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能——小吞噬实验第6页/共16页检测指标：1.吞噬百分率＝100个细胞中吞噬有细菌的细胞数人吞噬百分率正常参考值：62%~76%100×100%2.吞噬指数＝100个中性粒细胞吞噬的细菌总数人吞噬指数正常参考值：1.32~1.72100第7页/共16页(1)显微镜、香柏油、小试管、EP管、载玻片、酒精棉球、吸管、水浴箱等。(2)肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。(3)菌液制备：白色葡萄球菌18～24小时内汤培养物，经McFarland比浊法调整浓度至6～9×109/mL，加热100℃15分钟杀死细菌，置4℃保存备用。实验材料第8页/共16页(1)仔细消毒后，每个班取5ml静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。实验方法(3)取出EP管，用吸管吹打混匀后，取1滴“全血-白色葡萄球菌混合液”置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。(2)每个组(2~3人)取4滴抗凝血于EP管内，再加入2滴备好的白色葡萄球菌菌液，充分混匀后，置37℃水浴20min，中途混匀1次。(4)待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。第9页/共16页瑞氏染色瑞氏染液数滴覆盖血涂片上染色1min再加等量的PH6.8PBS与染液混合，染色10~15min用蒸馏水冲洗（平持玻片，在一端加水，使染料“漂走”）自然干燥第10页/共16页显微镜油镜原理显微镜的放大倍数和分辨率

1.放大倍数接物镜放大倍数×接目镜放大倍数2.

显微镜的分辨率表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=λ/2n·sin(α/2)D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。第11页/共16页油镜使用的原理

1.香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。

2.提高了显微镜的分辨率第12页/共16页显微镜油镜的使用方法

1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。

2.调节光亮度

3.低倍镜观察：粗调、细调

4.依次再进行中倍、高倍观察5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。

7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。

第13页/共16页油镜观察首先寻找中性粒细胞——观察胞质中有无吞噬的细菌。如染色正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而中性粒细胞胞浆染成淡红色。计算吞噬百分率和吞噬指数第14页/共16页(1)人类白细胞的吞噬活性在37℃时最好，温度过高过低均会使其吞噬能力减低。注意事项(2)个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。(4)取“细菌－全血”涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要求推出尾部，过厚或过薄