酶学基础三课件

酶学基础（三）1.1.5酶促反应的机制

1.酶－底物复合物的形成(1)中间产物学说：E+SESE+P(2)酶与底物结合特点：1）可逆的、非共价的结合；2）底物只与酶的活性中心结合；3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契合模式进行的。

k1

k-1k2酶促反应：E+S===ESEP

E+P反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化H。而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用

2.活化能降低酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反应中间物。其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。

3、影响酶催化的有关因素(1)底物与酶的靠近及定向(2)“张力”和“形变”(3)酸碱催化(4)共价催化(5)金属离子催化作用在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。3、影响酶催化的有关因素

(1)底物与酶的靠近及定向定向效应(2)“张力”和“形变”

底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。组氨酸的咪唑基：（1）pI值约为6.7-7.1，在接近中性的条件下，一半以广义酸的形式存在，另一半以广义碱的形式存在，因而它既能作为质子供体，又能作为质子受体，有效地进行酸碱催化。（2）咪唑基供出和接受质子的速度很快，其半衰期短，小于0.1毫微秒。所以许多酶活性中心都有组氨酸残基。酶分子中可作为酸碱催化的功能基团(4)共价催化某些酶在催化过程中，能通过共价键与底物结合成不稳定的酶-底物复合物，这个中间产物很容易变成过渡中间物，反应的活化能大大降低。(5)金属离子催化作用

金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。提高水的亲核性能

电荷屏蔽作用电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+-ATP复合物。

（二）作用机理1.通过电荷转移，使Ser有更强的亲核力；2.放出产物P1,N末端；3.形成产物P2，C末端；底物结合底物形成共价ES复合物His57质子供体C-N键断裂R-NH2氨基产物释放水亲核攻击H2O四面体中间物的瓦解羧基产物释放胰凝乳蛋白酶催化反应的详细机制1.3.酶活力的概念及其测定（一）酶活力的概念及表示方法1.概念：检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。活力单位：规定条件（最适条件）下，一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。国际单位（U）:指在最适条件下，1分钟内催化1微摩尔(umol)底物的酶量，或是转化1微摩尔(umol)底物中的有关基团的酶量。Katal：指在最适条件下，每秒钟催化1mol底物转化所需的酶量。简称Kat。2.酶活力的表示方法1Kat=6×107U3.酶的比活力酶的比活力：是指单位重量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，即每mg蛋白所含的酶活力单位或每kg蛋白中所含的Kat数。比活力是表示酶制剂纯度的一个指标。比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)/mg蛋白实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少）。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力［总活力=比活力×总体积（总重量）］

终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。

动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。（二）酶活力的测定测定初速度最适条件[S]》[E]要求斜率=[P]/

t=V（初速度）[P]t酶活力的测定的具体方法1）比色法

适用于酶的催化产物与特定物质反应生成有色的溶液2）分光光度法产物吸光度值与底物不同3）滴定法4）量气法5）同位素测定法6）酶偶联分析法葡萄糖＋O2葡萄糖氧化酶葡萄糖酸＋H2O2H2O2+4-氨基安替吡林过氧化物酶H2O+醌类化合物在500nm处测定光密度酶活力的测定：根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液