RAW2647小鼠巨噬细胞protocol

RAW264、7细胞株得相关信息ATCC:美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)得简写收到冷冻管细胞得处理方式1。1。收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形,若有请立即通知。细胞株于–70℃,隔夜后,移到液氮)。2。2。收到T25flask细胞得处理方式ﻫ于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。T25flask静置于37℃,5%CO2培养箱中,使细胞回温至37℃,并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长。k仅留约5—10ml培养基于flask内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘,则将细胞做传代培养。一、RAW264、7细胞培养得特点RAW可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形,较深。贴壁特别牢固。2、RAW264。7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这就是培养这种细胞时4、对于RAW264.7细胞她得声场时喜欢结伴。正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接,等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层、所以,要很好地控制好细胞得生长速度,不要等到叠加成层得时候再传代。RAW短,半小时就能贴很多,刚贴壁就是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面、生长一段时间后,部分细胞会变成类似四老化掉、1)将培养瓶内旧得培养液弃掉,然后用D－Hanks液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶得消化酶得消化作2)加入0。25%胰酶-EDTA消化,25cm培养瓶加0。4ml,37度消化5min,镜下瞧到细胞变3)立即加含10%FCS得培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但就是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞得损伤极小4)离心,弃上清,加新得培养液(10％FCS),小心吹匀,分装入新得培养瓶1.配制冻存培养液;(通用得为培养基:血清:DMSO=7:2:1,但其中得血清可进行调整,2、取对数生长期得细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长得细胞消化下来,4、去除胰蛋白酶及旧得培养液,加入适量配制好得冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞得最终密度为5×106/ml~1×107／ml;5.将细胞分装入冻存管中,每管1~1、5ml(不超过冻存管容量得80%);6、在冻存管上标明细胞得名称,冻存时间及操作者;7。冻存:标准得冻存程序为降温速率-1~—2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至—5℃~－10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞得冻存管放入－2h、(具体操作为4°C20min,-20°C30min,—70℃过夜,转入液氮中)in2。从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;4。弃去上清液,加入含10％小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;(复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)胞状1。倒掉旧得培养基,加入3ml新得培养基(有无血清得都可)洗涤一次,用滴管吸走,然ml得培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。这时侯再开始正式得消化、吹打。2。把吹打下来得细胞悬液加入到新得培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养择一个时间点,已经有部分细胞贴壁得情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中得培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。不明之处:培养之前,一切与细胞接触得玻璃器皿与器具都要进行过去热源处理。(200－25RAW264.7细胞株CellCulture得材料(一)仪器1.净化工作台(二)玻璃器皿(三)塑料器皿2.枪头6、冻存管(1~2ml)(四)其她物品2.红血球计数板4.医用橡皮膏5.移液枪试剂4.双抗(青霉素、链霉素)7.DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油级胎牛血清1、ﻫHyclone得特级胎Hyclone特级胎牛血清(DefinedFBS),货号SH30070,就是世界上唯一含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤10mg/dl。ﻫ此血清可以广泛用于各种细胞培养,2、Gibco得特级胎牛血清稍次一点得就是Gibco公司在美国原装生产得特级胎牛血清,这款血清,货号就是16000—044,就是100nm过滤3次,内毒素与血红蛋白含量都可以与。家生物行业类得著名供应商,成立于1978年,大部分血清得采集与加工都在加利FDA证得cGMP血源来自北美与澳大利亚BioInd公司得生产完全符合GMP得要求,并通过lIndustries主营细胞培养类产品,BioInd工厂加工得胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。根据美国农业部标准,原始血清均采自未发生疯牛病(BSE)与口蹄作台都通过高效微粒空气过滤器过滤,并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微得质量1.Hyclone得加拿大优等胎牛血清ﻫ性价比最高得就是Hyclone加拿大优等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396。03血清采自加拿大,由hyclone公司总部得员工采集加工,采集方法,加工过程,检定标准与美国原产优等胎牛血5EU/ml,血红蛋白含量≤25mg/dlHyclone级别测依据美国药典(USP)与美国联邦法规第九篇(9CFR),内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg／dl,完全符合美国HyClone＆reg;优等胎牛血清得此胎牛血清属于澳大利亚生产得,不在疫区,可以正常报关进口,目前没有受到任何影响,所以,就目前而言,算就是最好得胎牛血清了,有不少客户都此血清来培养大利亚胎牛血清差不多,市场价也就是2300元/500ml左右。这一级别得血清,也第三类,一般级别得进口胎牛血清、ﻫ1Hyclone得南美胎牛血清目前,市场上用得最多得Hyclone血清就是南美胎牛血清(FBS)SV30087,此,根据中国商标法得规定标贴中文标签,内毒素含量≤10EU／ml,血红蛋白含量≤20mg/d、ﻫ此血清广泛用于各种肿瘤细胞得培养,还没有资料记载能够用于干细胞,也听说有少数人用于干细胞培养得,不过,因为本身血红素比较高,所以,最好不要用于干细胞,mGemini血清4、TCB得胎牛血清5、ﻫPAA得胎牛血清进行过滤分装。普普通液体培养基列表BME培养基(BasalMediumEagle)高糖,不含L－谷氨酰胺与丙酮酸钠。Medium)●●●●●SH30081.02500ml500ml6x500ml6x500ml1000ml0ml20L袋装ml2－8°C高糖,含L－谷氨酰胺,不含酚红与丙酮酸钠。高糖,含丙酮酸钠,不含L－谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。高度改良,含丙酮酸钠、25mMHEPES,不含L－谷氨酰胺。g含2。50mML－谷氨酰胺、15mMHEPES。含HEPES,不含L-谷氨酰胺。●SH30243。02●SH30243.LS○SH30243。04●SH30284、01●SH30285、FSSH585、02SH○SH30563。02○SH30607。01●SH30021.02●SH30023、FS●SH30023、02●SH30126、FS6x500ml10L袋装20L袋装1000ml1000ml1000mll1000mlx000ml500ml1000ml500ml1000ml500ml1000ml1000mlml2—8°C2－8°C2－8°C●SH30271.01500ml2—8°C含L-谷氨酰胺,不含HEPES。含L－谷氨酰胺,不含HEPES、酚红。Ham”s培养基(Ham’sNutrientMixture)Grace”s无添加剂培养基TNM-FH培养基●SH30026、FS○SH30526、026x500ml500mlml500mlmlml1000ml500ml2－8°C2-8°C2—8°C2－8°C2-8°CIMDM培养基(Iscove"sModifiedDulbecco＂sMedium)含L-谷氨酰胺、HEPES,不含α-硫代甘油。Leibovitz培养基(LeibovitzMedium)HBSS＊,含L－谷氨酰胺。McCoy"s5A培养基(McCoy"s5AMedium)●SH30228、01BSH01●SH30525.01●SH30253、01B○SH30233、02500ml500ml1000ml500ml1000ml500mlx5001000ml2—8°C2—8°C2－8°C2－8°C含L-谷氨酰胺、HEPES、MEM培养基(MinimumEssentialMedium)EBSS＊,不含L－谷氨酰胺。●SH30024。02●SH30244。01500ml2—8°CC500ml2-8°C6x500m2－8°Clx1000ml2-8°C500ml2－8°C500ml2—8°C6x5002-8°CmlHB6x1000500ml6x500ml●SH30568。01500ml2-8°C○SH30568、021000ml2-8°CRichter”s改良型,含L—谷氨酰胺、酚红。SHml8°CRPMI1640培养基(RPMI1640Medium)1X,含2、05mML—谷氨酰胺(同SH30091)。500ml2－8°C2－8°C11X,含2.05mML－谷氨酰胺(同SH30027)。20L袋装2—8°C10L袋装2—8°C500ml2－8°C●SH30096.FS2－8°Cl●SH3