ELISA试验基本步骤材料和试剂

注意：本步骤为间接ELISA步骤一主要步骤包被取所要包被的物质，提早设计好所需浓度，依据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接置4℃留宿；也能够先置37℃孵育2小时再转入4℃留宿。清洗包被结束后弃偷换被液，用PBST进行清洗，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，从头加满，重复清洗3-5次，最后拍干ELISA板等候下一步关闭。关闭常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加关闭液至每孔，体积起码为所加包被液的两倍。关闭条件也有两种选择：直接置于4℃留宿，或许置于37℃温育2-4h，详细何种条件不一样物质的ELISA可能不一样。清洗关闭结束的ELISA板进行清洗，方法同步骤2。最后拍干等候加入一抗。加入一抗一抗即为你要检测的物质，一般加以前需要稀释，详细稀释倍数不一样实验不一样需要自己探索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反响条件为37℃孵育2h。清洗详细同步骤4。7加相应HRP-标志的商品化二抗加相应的商品化HRP-标志的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用关闭液稀释，稀释倍数参照二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔，37℃反响。清洗详细同步骤4。显色常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也实用TMB作为底物，，这里只介绍前者。显色需要配置显色液，详细方法为：在步骤8进行到一半使配置显色液，为10ml底物缓冲液加OPD粉末（实质操作因为OPD有毒不方便称量故只要略微加入一点即可），等候OPD完整溶解。待步骤8达成后取150ul3%过氧化氢溶液加入以前配置的10ml溶液中混匀，马上将此显色液分加至ELISA各孔中。而后将ELISA板置于37℃反响约10min。停止将ELISA板拿出，每孔加停止液（2mol/L硫酸溶液）停止反响，马上到酶标仪上读数（OPD为底物是读数波长为490nm，TMB为底物时波长为450nm）。二资料、试剂1ELISA板专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式，需要购置。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯资料。注意：聚苯乙烯资料当前只有入口，特色是孔大，加满约300ul，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等）均为100ul体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约200ul，此时各试剂只要加50ul体积即可。各试剂配制1）包被液（的碳酸盐缓冲液）无水Na2CO3NaHCO30.2856gSW100ml完整溶解至4℃,一周内使用2）PBST配方NaCl8.0g2.9gKCl0.2gKH2PO40.24gTW-20SW1000ml底物缓冲液Na2HPO43.682g柠檬酸1.02gDW200ml不需灭菌，4℃保留4）3%H2O230%H2O2100mlSW900ml5）显色剂底物缓冲剂10ml3%H2O2150ulOPD15mg此中H2O2最后加6）停止液浓硫酸：SW=1:8浓硫酸迟缓加入到SW中，并搅拌散热三注意事项包被所谓37℃反响，一般取一个37℃的水浴锅，在水面放一较大泡沫板，将ELISA板置于泡沫板上即可，其余步骤的37℃反响操作同此；整个ELISA过程中全部需要较长时间等候的步骤（包被、关闭、加一抗孵育、加二抗孵育）均需要将ELISA包起来再放入冰箱或水浴锅中，一般可直接用一次性EP手套套起来即可。清洗最惯例的清洗步骤是清洗3次，每次间隔5min，详细实验可能会微调，清洗次数能够3-6次不等，间隔5-10min不等；每次清洗后要将ELISA板尽可能拍干后在进行下一步操作，特别是每个清洗步骤的最后一次清洗要尽可能拍干，拍干可在纱布、吸水纸长进行，也能够购置洗板机。显色配制显色液时3%过氧化氢必定要最后加入，加入混匀后马上