CcdB分子生物学研究进展

PAGEPAGE10学号昆明理工大学硕士研究生综述专业微生物学姓名入学时间日期20**年1月8日

CcdB分子生物学研究进展摘要：毒素-抗毒素系统广泛存在于质粒及大肠杆菌染色体中，在缺乏抗毒素的情况下，毒素通过作用于细胞内不同的酶，使细胞中毒，最终导致细胞死亡。本文综述了ccd系统及自杀基因ccdB的作用原理和机制。关键词：毒素-抗毒素系统、Ccd系统、CcdB Keywords:Toxin-antitoxinsystem,Ccdsystem,CcdB毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin，TA）系统是一种可能与细胞生长阻滞或是细胞凋亡有关的系统。该系统最初发现存在于大肠杆菌F质粒上ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1]，典型的TA系统由两个基因构成。两个基因分别编码一种稳定的毒素蛋白和一种不稳定的抗毒素蛋白，毒素对细菌有致死作用，而抗毒素通过与毒素形成复合体，中和毒素的毒性，使宿主菌能够存活。TA系统主要存在于一些低拷贝质粒上，细菌分裂后，不稳定的抗毒素蛋白被迅速降解，不具有质粒的子代细菌就会被稳定的毒素蛋白杀死，这种作用称为分裂后致死效应（thepostsegregationkillingeffect，PSK），近一步研究发现在大肠杆菌的染色体上也存在TA系统，但染色体上的抗毒素蛋白对毒素蛋白并不能起到解毒的作用，只有依靠质粒上的抗毒素蛋白才能保证细菌存活，低拷贝质粒正是依靠TA系统的PSK效应，稳定在宿主中存在。目前已知的TA系统包括7个质粒编码TA基因家族：ccd、mazEF、vapBC、phd/doc、parDE、higBA和relBEADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[2,3]。虽然TA系统在基因结构和调控模式上十分相似，但是每种毒素的作用原理却存在很大差异。CcdB和ParE通过使促旋酶失活抑制DNA复制，使细胞中毒。RelE通过切割mRNA，抑制翻译过程导致细胞凋亡。而HigB的作用机理目前尚不清楚。1．Ccd系统Ccd（controlofcelldivisionordeath）为F质粒小F复制子上的一个组件，F质粒共编码三种TA基因系统ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]，Ccd系统ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王晓蕾</Author><Year>2021</Year><RecNum>5</RecNum><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="9ww25evxo2rtzhe9fxl5x0282edfdf9rxawd">5</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王晓蕾</style></author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMolecularBiology,OdenseUniversity,SDU,DK-5230OdenseM,Denmark.kgerdes@molbiol.sdu.dk</auth-address><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">细菌毒素-抗毒素系统的研究进展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">生物化学与生物物理进展</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>生物化学与生物物理进展</full-title></periodical><pages>991~997</pages><volume>35</volume><number>9</number><keywords><keyword>AminoAcidSequence</keyword><keyword>Antitoxins/genetics/*physiology</keyword><keyword>BacterialToxins/genetics/*metabolism</keyword><keyword>ChromosomeMapping</keyword><keyword>Databases,Factual</keyword><keyword>Genes,rel</keyword><keyword>MolecularSequenceData</keyword><keyword>*NutritionPhysiology</keyword><keyword>SequenceAlignment</keyword></keywords><dates><year>2021</year></dates><isbn>0021-9193(Print)</isbn><accession-num>10633087</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=10633087</url></related-urls></urls><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[5]只是其中的一种，由CcdA和CcdB两个基因共同构成，也可以称为H、G或是letA、letB，分别编码两种小分子量蛋白：CcdA蛋白（8.7kDa）与CcdB蛋白（11.7kDa）。CcdA蛋白易被Lon蛋白酶降解，在系统中起到解毒剂的作用，CcdB蛋白较CcdA蛋白稳定，是一种细胞毒素，在没有解毒剂存在的条件下，可以导致细胞凋亡。2．CcdBCcdB编码一个101个氨基酸的蛋白（图1），能使DNA促旋酶复合体中毒，并抑制促旋酶的活性。图1CcdB蛋白二聚体的二级结构拓扑图ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]红色的为5条反向平行的β—折叠，稍短的3条紫色的为翼型折叠，黄色为C端的α螺旋。但是，当存在CcdA蛋白时，CcdB蛋白活性因为形成CcdA-CcdB紧密复合体而受到一定程度的抑制。3.CcdB蛋白作用原理3.1促旋酶促旋酶是一种在原核生物有机体中必须存在且高度保守的酶，属于拓扑异构酶=2\*ROMANII，大肠杆菌促旋酶作为一种罕有的拓扑异构酶，在ATP存在时，能够解除负超螺旋。大肠杆菌促旋酶为四聚体，由两个GyrA亚基（97kDa）和两个GyrB亚基（90kDa）组成。GyrA亚基有两个功能不同的结构域ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Hargreaves</Author><Year>2021</Year><RecNum>5</RecNum><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="ztara99rtpxf0oearsuva0do9zptzwwzss0x">5</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Hargreaves,D.</author><author>Santos-Sierra,S.</author><author>Giraldo,R.</author><author>Sabariegos-Jareno,R.</author><author>delaCueva-Mendez,G.</author><author>Boelens,R.</author><author>Diaz-Orejas,R.</author><author>Rafferty,J.B.</author></authors></contributors><auth-address>KrebsInstituteforBiomolecularResearch,DepartmentofMolecularBiologyandBiotechnology,UniversityofSheffield,WesternBank,UnitedKingdom.</auth-address><titles><title>StructuralandfunctionalanalysisofthekidtoxinproteinfromE.coliplasmidR1</title><secondary-title>Structure</secondary-title></titles><periodical><full-title>Structure</full-title></periodical><pages>1425-33</pages><volume>10</volume><number>10</number><edition>2021/10/16</edition><keywords><keyword>AminoAcidSequence</keyword><keyword>Crystallography,X-Ray</keyword><keyword>Escherichiacoli/*chemistry</keyword><keyword>EscherichiacoliProteins/*chemistry/*pharmacology</keyword><keyword>Models,Molecular</keyword><keyword>MolecularSequenceData</keyword><keyword>*Plasmids</keyword><keyword>ProteinConformation</keyword><keyword>SequenceHomology,AminoAcid</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Oct</date></pub-dates></dates><isbn>0969-2126(Print)</isbn><accession-num>12377128</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=12377128</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>S0969212602021560[pii]</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[7]，其中N-端结构域（59kDa）与DNA断裂-修复有关，而C-端结构域（37kDa）为DNA结合结构域，与DNA折叠有关，整个GyrA亚基形成酶的催化中心，与DNA断裂—再接合反应有关。GyrB亚基同样由两个结构域组成，N-端结构域（43kDa）决定着促旋酶的活性，其作用是结合和水解ATP，C-端结构域（47kDa）的功能目前还不清楚ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Oram</Author><Year>2021</Year><RecNum>2</RecNum><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="txtsf0s0ot0x5oestdo559djfsdzfd555pdr">2</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>MarkOram</author></authors></contributors><titles><title>DissectionoftheBacteriophageMuStrongGyraseSite(SGS):SignificanceoftheSGSRightArminMuBiologyandDNAGyraseMechanism</title><secondary-title>JOURNALOFBACTERIOLOGY</secondary-title></titles><periodical><full-title>JOURNALOFBACTERIOLOGY</full-title></periodical><pages>619-632</pages><volume>188</volume><number>2</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[8]。3.2CcdB蛋白与促旋酶的相互作用促旋酶通过GyrA亚基上的Tyr122共价结合DNA，并诱发DNA的断裂，断裂的DNA称为G-segment，同时，另一条称为T-segment的完整DNA穿过G-segment的断裂处，释放到DNA-促旋酶复合体以外，G-segment在原断裂处重新被修复。正是通过这样的断裂—再接合反应，促旋酶不断地向DNA结构中引入负超螺旋，使基因的转录和复制能够顺利进行。体外实验证明：CcdB蛋白存在时，促旋酶GyrA亚基和CcdB蛋白直接结合，形成复合体（α复合体），CcdB蛋白对促旋酶水解ATP和促发超螺旋的能力没有影响，即对促旋酶没有毒性。但是，当GyrB亚基存在时，α复合体会缓慢转变为另一种复合体——β复合体。β复合体能够水解ATP，但不产生超螺旋，对促旋酶存在毒性。中毒后的促旋酶使DNA只发生断裂却不能修复，进而减少细胞DNA合成ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dwyer</Author><Year>2021</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="txtsf0s0ot0x5oestdo559djfsdzfd555pdr">3</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>DanielJDwyer</author></authors></contributors><titles><title>GyraseinhibitorsinduceanoxidativedamagecellulardeathpathwayinEscherichiacoli</title><secondary-title>MolecularSystemsBiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>MolecularSystemsBiology</full-title></periodical><pages>1-15</pages><volume>3</volume><number>91</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[9]，激发SOS反应ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>华跃进</Author><Year>2021</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0esz9xetkpsfwwex2z1xsx5q90davet9advx">1</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">周庆陈微微张新觉徐虹徐步进华跃进</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">耐辐射球菌不存在经典的SOS反应</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">科学通报</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>科学通报</full-title></periodical><pages><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">534-539</style></pages><volume><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">52</style></volume><number><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">(5)</style></number><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">2021</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[10]，形成无核细胞，最终导致细胞凋亡。4.CcdB蛋白作用机制研究表明：大肠杆菌中的CcdB蛋白主要有两种作用：1、捕捉断裂的DNA—促旋酶复合体并使其中毒；2、造成大肠杆菌T7聚合酶通路的中断ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dimitri</Author><Year>2021</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="efz02wxv1s9xwre5as15szvq5s5s5dxvzeer">1</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Dimitri,A.</author><author>Jia,L.</author><author>Shafirovich,V.</author><author>Geacintov,N.E.</author><author>Broyde,S.</author><author>Scicchitano,D.A.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiology,NewYorkUniversity,1009SilverCenter,100WashingtonSquareEast,NewYork,NY10003-6688,UnitedStates.</auth-address><titles><title>TranscriptionofDNAcontainingthe5-guanidino-4-nitroimidazolelesionbyhumanRNApolymeraseIIandbacteriophageT7RNApolymerase</title><secondary-title>DNARepair(Amst)</secondary-title></titles><periodical><full-title>DNARepair(Amst)</full-title></periodical><pages>1276-88</pages><volume>7</volume><number>8</number><edition>2021/06/17</edition><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Aug2</date></pub-dates></dates><isbn>1568-7864(Print)</isbn><accession-num>18555749</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=18555749</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>S1568-7864(08)00141-9[pii] 10.1016/j.dnarep.2021.04.007</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[11]。因此，最初的研究者们认为：CcdB蛋白的作用机制可能与喹诺酮类药物类似ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李碧青</Author><Year>2021</Year><RecNum>2</RecNum><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0esz9xetkpsfwwex2z1xsx5q90davet9advx">2</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">赖阜培李碧青</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">喹诺酮类药物的常见不良反应</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">社区医学杂志</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>社区医学杂志</full-title></periodical><pages>21-22</pages><volume>6</volume><number>4</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[12]，即与GyrA的N端区域相互作用，触发一个快速却不依赖ATP的，稳定的促旋酶—DNA复合体，诱发DNA损伤，导致双链断裂ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Tran</Author><Year>2021</Year><RecNum>2</RecNum><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="efz02wxv1s9xwre5as15szvq5s5s5dxvzeer">2</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Tran,J.H.</author><author>Jacoby,G.A.</author><author>Hooper,D.C.</author></authors></contributors><auth-address>DivisionofInfectiousDiseases,MassachusettsGeneralHospital,55FruitSt.,Boston,MA02114-2696,USA.</auth-address><titles><title>Interactionoftheplasmid-encodedquinoloneresistanceproteinQnrwithEscherichiacoliDNAgyrase</title><secondary-title>AntimicrobAgentsChemother</secondary-title></titles><periodical><full-title>AntimicrobAgentsChemother</full-title></periodical><pages>118-25</pages><volume>49</volume><number>1</number><edition>2021/12/24</edition><keywords><keyword>Anti-BacterialAgents/pharmacology</keyword><keyword>Anti-InfectiveAgents/*pharmacology</keyword><keyword>Ciprofloxacin/pharmacology</keyword><keyword>DNAGyrase/*metabolism</keyword><keyword>*DrugResistance,Bacterial/genetics</keyword><keyword>Escherichiacoli/*drugeffects/genetics/metabolism</keyword><keyword>EscherichiacoliProteins/*metabolism</keyword><keyword>Plasmids/genetics</keyword><keyword>Quinolones/*pharmacology</keyword><keyword>RecombinantFusionProteins/metabolism</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Jan</date></pub-dates></dates><isbn>0066-4804(Print)</isbn><accession-num>15616284</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=15616284</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>49/1/118[pii] 10.1128/AAC.49.1.118-125.2021</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[13]。但是，后来的研究表明CcdB蛋白作用机理较喹诺酮类药物更为复杂。对能量的依赖性：在从CcdB蛋白使DNA促旋酶中毒，到完成切割线性DNA的过程中，能量ATP是一个不可缺少的重要因素ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[14]。研究表明：用非水解产物ATP类似物ADPNP和ADPCP代替ATP，在CcdB蛋白存在的情况下，并不能促发CcdB蛋白对DNA的切割作用。通过对促旋酶进行改造，得到能结合ATP，但不能使其水解的促旋酶突变体，当CcdB蛋白作用于该突变体时，即使存在ATP，也不能促发线性DNA的切割反应。但是，以上现象仅出现在线性DNA和松弛型闭合环状DNA中，对于负超螺旋DNA而言，不存在能量上的依赖现象ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>SaeedM.Hashimi</Author><Year>20October2021</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="d2v5wrxxkvepd8ed92pvaxrkap9za2f5wwte">1</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">SaeedM.Hashimi,1MelisaK.Wall,2</style><styleface="normal"font="default"charset="128"size="100%">†AndrewB.Smith,2‡AnthonyMaxwell,2andRobertG.Birch1*</style></author></authors></contributors><titles><title>ThePhytotoxinAlbicidinisaNovelInhibitorofDNAGyrase</title><secondary-title>ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY</secondary-title></titles><periodical><full-title>ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY</full-title></periodical><volume>51</volume><dates><year>20October2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[15]。4.2对DNA片段长度的要求在CcdB蛋白介导的DNA切割反应中，DNA片断长度对切割效率有着很大的影响，最小长度要求为160bp，而喹诺酮类药物可介导切割的双链DNA片断长度最小为20bp，但并不是只要大于160bp的DNA都能在CcdB蛋白存在的情况下被切开，相反，CcdB蛋白，对DNA的切割作用在DNA长度上要求非常严格，原理目前还没有明确的定论。4.3与促旋酶结合的区域喹诺酮类药物与促旋酶结合的区域为GyrA亚基第67个氨基酸至106个氨基酸之间的保守区域（QRDR）。GyrA亚基与ccdB蛋白相互作用的位点为Arg462，GyrA亚基与DNA共价结合的位点为Tyr122（图2）。图2促旋酶GyrA亚基的结构ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>VanMelderen</Author><Year>2021</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xxvd5wdp2xa5sfet2e45asa42pes9vsr9sxt">1</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>VanMelderen,L.</author></authors></contributors><auth-address>LaboratoiredeGenetiquedesProcaryotes,InstitutdeBiologieetMedecineMoleculaires,UniversiteLibredeBruxelles,Gosselies,Belgium.lvmelder@dbm.ulb.ac.be</auth-address><titles><title>MolecularinteractionsoftheCcdBpoisonwithitsbacterialtarget,theDNAgyrase</title><secondary-title>IntJMedMicrobiol</secondary-title></titles><periodical><full-title>IntJMedMicrobiol</full-title></periodical><pages>537-44</pages><volume>291</volume><number>6-7</number><edition>2021/03/14</edition><keywords><keyword>BacterialProteins/*metabolism</keyword><keyword>BacterialToxins/*metabolism</keyword><keyword>DNAGyrase/antagonists&inhibitors/*metabolism</keyword><keyword>DNA,Bacterial/metabolism</keyword><keyword>Escherichiacoli/chemistry/enzymology/*metabolism</keyword><keyword>Models,Molecular</keyword><keyword>Plasmids</keyword><keyword>ProteinBinding</keyword><keyword>Quinolones/pharmacology</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Feb</date></pub-dates></dates><isbn>1438-4221(Print)</isbn><accession-num>11890555</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=11890555</url></related-urls></urls><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[4]CcdB蛋白存在时，DNA的切割作用过程（图3）。(a)在缺乏DNA时，促旋酶处于静止状态，此时的GyrB夹子是开放的；(b)第一段DNA(Gsegment)能够与静止期的酶反向结合；(c)G片断（Gsegment）断裂，断裂的两部分仍然以共价键结合到GyrA亚基酪氨酸残基活性位点Tyr122上，形成所谓的切割复合体。第二段DNA片断(Tsegment)进入到GyrB夹子；(d)一旦ATP与促旋酶结合，促旋酶的GyrB夹子立刻关闭。这使得GyrA亚基二聚体的构象平衡达到其开放式构造。Tsegment便可以通过G门，DNA增加两个负超螺旋；(e)在Tsegment通过之前，CcdB蛋白可以与促旋酶结合，但结合之后，G门便不再关闭，形成切割复合体；(f)而在缺乏CcdB蛋白的条件下，GyrA亚基的主要出口会在瞬间开放来释放Tsegment，随即关闭；(g)在Tsegment释放过程结束后，ATP被水解，酶又恢复到静止的状态。开始新一轮超螺旋的形成，或者进行Gsegment的选择性连接，使酶释放超螺旋DNA。图3CcdB使促旋酶中毒的机制ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[16]蓝色：GyrA亚基；绿色：GyrB亚基；红色：DNA链；黄色：CcdB蛋白5.抗毒素CcdA与毒素ccdB间的相互作用作为Ccd系统抗毒素的CcdA蛋白有两个不同，相互独立的结构域组成：N-端结构域和C-端结构域。N-端结构域结合DNA，对蛋白的结合不起任何作用，也不会因为蛋白在其它位点上的结合，而出现结构上的变化；C-端结构域则负责同毒素CcdB蛋白结合ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[17]。CcdB与CcdA间的相互作用很复杂，依赖于两者间浓度的比例，产生不同的复合物。当CcdA与CcdB间的比率大于或等于1时，CcdA二聚体会与CcdB二聚体形成复合体，在体外表现出很强的DNA结合能力，螺旋环绕在120bp的启动子区域，这时发挥抑制作用。而当CcdA与CcdB的比例小于1时，就会形成一种由一个CcdA二聚体与两个CcdB二聚体形成的复合体，此时没有抑制作用。正是由于CcdA可以高效地结合CcdB，所以，CcdA蛋白可以从无活性的CcdB-GyrA复合体中夺取CcdB蛋白，从而使GyrA恢复原有的活力。6.CcdB应用展望由于CcdB对大肠杆菌促旋酶的强毒性效应，ccdB基因可以被构建到表达载体上作为转化时的选择标记，如Invitrogen公司推出的Gateway®VectorConversionSystemwithOneShot®ccdBSurvivalTMCompetentCells，就是在Gateway原理的基础上，在中间载体两个重组位点序列间添加ccdB基因。ccdB基因的表达产物能抑制普通E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化后不能生长。ccdB的选择作用加上抗生素筛选，转化产物重组率可以高达90%以上。需要特别注意的是在CcdB存在的条件下，表达载体只能被转化到非大肠杆菌宿主菌或是促旋酶发生突变的大肠杆菌中ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ball</Author><Year>27September2021</Year><RecNum>4</RecNum><record><rec-number>4</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="d2v5wrxxkvepd8ed92pvaxrkap9za2f5wwte">4</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>RebeccaD.ParrandJudithM.Ball</author></authors></contributors><titles><title>Newdonorvectorforgenerationofhistidine-taggedfusionproteinsusingtheGatewayCloningSystem</title><secondary-title>ShortCommunication</secondary-title></titles><periodical><full-title>ShortCommunication</full-title></periodical><pages>5</pages><volume>Plasmid</volume><number>49</number><edition>183</edition><section>179</section><dates><year>27September2021</year><pub-dates><date>2021</date></pub-dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[18]。由于TA系统对细胞的杀伤作用是通过自然选择产生的，较之抗生素的抗菌作用，其所产生的抗药性的突变率要小得多。所以，通过对这些天然毒素作用方式的研究，可以更好的理解靶标酶的结构及作用机理，这为设计新的抗多重耐药细菌的治疗性药物提供了重要依据。参考文献ADDINEN.REFLIST1. 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咖啡店创业计划书第一部分：背景在中国，人们越来越爱喝咖啡。随之而来的咖啡文化充满生活的每个时刻。无论在家里、还是在办公室或各种社交场合，人们都在品着咖啡。咖啡逐渐与时尚、现代生活联系在一齐。遍布各地的咖啡屋成为人们交谈、听音乐、休息的好地方，咖啡丰富着我们的生活，也缩短了你我之间的距离，咖啡逐渐发展为一种文化。随着咖啡这一有着悠久历史饮品的广为人知，咖啡正在被越来越多的中国人所理解。第二部分：项目介绍第三部分：创业优势目前大学校园的这片市场还是空白，竞争压力小。而且前期投资也不是很高，此刻国家鼓励大学生毕业后自主创业，有一系列的优惠政策以及贷款支持。再者大学生往往对未来充满期望，他们有着年轻的血液、蓬勃的朝气，以及初生牛犊不怕虎的精神，而这些都是一个创业者就应具备的素质。大学生在学校里学到了很多理论性的东西，有着较高层次的技术优势，现代大学生有创新精神，有对传统观念和传统行业挑战的信心和欲望，而这种创新精神也往往造就了大学生创业的动力源泉，成为成功创业的精神基础。大学生创业的最大好处在于能提高自己的潜力、增长经验，以及学以致用;最大的诱人之处是透过成功创业，能够实现自己的理想，证明自己的价值。第四部分：预算1、咖啡店店面费用咖啡店店面是租赁建筑物。与建筑物业主经过协商，以合同形式达成房屋租赁协议。协议资料包括房屋地址、面积、结构、使用年限、租赁费用、支付费用方法等。租赁的优点是投资少、回收期限短。预算10-15平米店面，启动费用大约在9-12万元。2、装修设计费用咖啡店的满座率、桌面的周转率以及气候、节日等因素对收益影响较大。咖啡馆的消费却相对较高，主要针对的也是学生人群，咖啡店布局、格调及采用何种材料和咖啡店效果图、平面图、施工图的设计费用，大约6000元左右3、装修、装饰费用具体费用包括以下几种。(1)外墙装饰费用。包括招牌、墙面、装饰费用。(2)店内装修费用。包括天花板、油漆、装饰费用，木工、等费用。(3)其他装修材料的费用。玻璃、地板、灯具、人工费用也应计算在内。整体预算按标准装修费用为360元/平米，装修费用共360*15=5400元。4、设备设施购买费用具体设备主要有以下种类。(1)沙发、桌、椅、货架。共计2250元(2)音响系统。共计450(3)吧台所用的烹饪设备、储存设备、洗涤设备、加工保温设备。共计600(4)产品制造使用所需的吧台、咖啡杯、冲茶器、各种小碟等。共计300净水机，采用美的品牌，这种净水器每一天能生产12l纯净水，每一天销售咖啡及其他饮料100至200杯，价格大约在人民币1200元上下。咖啡机，咖啡机选取的是电控半自动咖啡机，咖啡机的报价此刻就应在人民币350元左右