临床微生物检验标本的采集与合理使用抗生素

临床微生物检验标本的采集与合理使用抗生素第1页，共81页，2023年，2月20日，星期三主要内容一、开展微生物检验的必要性二、临床微生物室的任务三、与临床沟通中常见问题四、临床微生物标本的采集及运送原则第2页，共81页，2023年，2月20日，星期三一、开展微生物检验的必要性

为进一步促进抗菌药物合理使用，有效控制细菌耐药，保证医疗质量和医疗安全，《抗菌药物临床应用管理办法》（卫生部令第84号）已于2012年2月13日经卫生部部务会审议通过，现予以发布，自2012年8月1日起施行。范围：全国各级各类医疗机构，重点是二级以上公立医院。二级以上医院应当根据实际需要，建立符合实验室生物安全要求的临床微生物室。《办法》建立抗菌药物临床应用分级管理制度。根据安全性、疗效、细菌耐药性、价格等因素，将抗菌药物分为三级：非限制使用级、限制使用级与特殊使用级。具体划分标准如下：第3页，共81页，2023年，2月20日，星期三（一）非限制使用级抗菌药物是指经长期临床应用证明安全、有效，对细菌耐药性影响较小，价格相对较低的抗菌药物；

适用于轻度、局部感染（医师）如：青霉素、氨苄西林、阿莫西林、甲硝唑等第4页，共81页，2023年，2月20日，星期三（二）限制使用级抗菌药物是指经长期临床应用证明安全、有效，对细菌耐药性影响较大，或者价格相对较高的抗菌药物；

适用于严重感染、合并感染（主治）如：三代头孢、头孢哌酮/他唑巴坦、阿奇霉素、替硝唑第5页，共81页，2023年，2月20日，星期三（三）特殊使用级抗菌药物是指具有以下情形之一的抗菌药物：

1.具有明显或者严重不良反应，不宜随意使用的抗菌药物；

2.需要严格控制使用，避免细菌过快产生耐药的抗菌药物；

3.疗效、安全性方面的临床资料较少的抗菌药物；

4.价格昂贵的抗菌药物。

适用于病情危重会诊确认（主任）四代头孢、甘酰胺类（替加环素）、碳青霉烯类、糖肽类、恶唑酮类、卡泊分净、莫西沙星等第6页，共81页，2023年，2月20日，星期三

二、临床微生物室的任务

1.开展微生物培养、分离、鉴定和药物敏感试验等工作，提供病原学诊断和细菌耐药技术支持，参与抗菌药物临床应用管理工作。药物敏感试验定义：使用体外试验的方法检测细菌的耐药性，预测抗菌药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染问题选用药物提供依据----实施个体化治疗。第7页，共81页，2023年，2月20日，星期三

我院微生物室第8页，共81页，2023年，2月20日，星期三第9页，共81页，2023年，2月20日，星期三VITEK2-Compact全自动细菌鉴定仪第10页，共81页，2023年，2月20日，星期三BacTALERT3D全自动血培养仪第11页，共81页，2023年，2月20日，星期三CO2孵箱普通孵箱干燥箱第12页，共81页，2023年，2月20日，星期三染色槽第13页，共81页，2023年，2月20日，星期三标本传递仓、扫描条码接收标本第14页，共81页，2023年，2月20日，星期三2.医疗机构要根据临床微生物标本药敏结果合理选用抗菌药物:接受限制使用级抗菌药物治疗的住院患者抗菌药物使用前微生物检验样本送检率不低于50%；接受特殊使用级抗菌药物治疗的住院患者抗菌药物使用前微生物送检率不低于80%。第15页，共81页，2023年，2月20日，星期三

3.开展细菌耐药监测工作，定期发布细菌耐药信息，建立细菌耐药预警机制，针对不同的细菌耐药水平采取相应应对措施；医疗机构按照要求向全国抗菌药物临床应用监测网报送抗菌药物临床应用相关数据信息，向全国细菌耐药监测网报送耐药菌分布和耐药情况等相关信息。第16页，共81页，2023年，2月20日，星期三（1）主要目标细菌耐药率超过30%的抗菌药物，应当及时将预警信息通报本机构医务人员；（2）主要目标细菌耐药率超过40%的抗菌药物，应当慎重经验用药；（3）主要目标细菌耐药率超过50%的抗菌药物，应当参照药敏试验结果选用；（4）主要目标细菌耐药率超过75%的抗菌药物，应当暂停针对此目标细菌的临床应用，根据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复临床应用。第17页，共81页，2023年，2月20日，星期三

金黄色葡萄球菌（905株）对抗菌药物的敏感性(%)第18页，共81页，2023年，2月20日，星期三

大肠埃希菌（2634株）对抗菌药物的敏感性(%)第19页，共81页，2023年，2月20日，星期三

大肠埃希菌（2634株）对抗菌药物的敏感性(%)第20页，共81页，2023年，2月20日，星期三

鲍曼不动杆菌（854株）对抗菌药物的敏感性(%)第21页，共81页，2023年，2月20日，星期三

嗜麦芽窄食单胞菌（227株）对抗菌药物的敏感性(%)第22页，共81页，2023年，2月20日，星期三三、与临床沟通中常见问题1.我们想用的药物在药敏试验中没有做？药敏试验是参照美国的CLSI推荐的标准制定的。细菌全自动分析仪的药敏组合是固定的。某些细菌对某类抗生素天然耐药，则不需要做药敏试验。试验的药物代表一类药，而不是一种药。药物的敏感性可被其他药物所预报。第23页，共81页，2023年，2月20日，星期三2.为什么有的菌药敏报告很多种药物，有的仅报告几种药物？药敏试验是参照美国的CLSI推荐的标准制定的,我国也按照此标准执行。报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。第24页，共81页，2023年，2月20日，星期三CLSI药敏建议第25页，共81页，2023年，2月20日，星期三3.是否能将所用的药都做药敏试验?没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准）第26页，共81页，2023年，2月20日，星期三4.培养阳性的患者都需要用抗菌药物治疗吗？不是的培养阳性感染，可能为污染（血培养），也可能为定植（痰培养）任何结果必须结合临床情况进行评价（很重要）感染部位的清创、引流、换药比使用抗菌药物更加重要改善患者全身情况：器官功能支持，纠正酸碱平衡，电解质紊乱，低蛋白血症，高血糖等第27页，共81页，2023年，2月20日，星期三5.取的明显就是脓液标本，为何鉴定报告为无菌生长？因为可能脓汁中心的细菌被大量的中性粒细胞吞噬，已经死亡。我们尽量取化脓组织与正常组织交界处脓汁，交界处活菌较多，可提高检出率。我们做的是有氧培养，脓液可能为厌氧菌感染。第28页，共81页，2023年，2月20日，星期三6.选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效。可能不是真正的致病菌（污染或定植菌）细菌本身因素（如诱导耐药，生物被膜）感染部位与药代动力学因素细菌的MIC，给药剂量和用药方式药敏试验药物中有些药物单独使用无效，但可以与其他药物联合用药药物剂型及生物利用度（纯品、商品）第29页，共81页，2023年，2月20日，星期三7.涂片镜检结果与培养结果不吻合？涂片镜检是报告所有检见的细菌，而培养的目的是检出致病菌。一些苛氧菌需在特殊的环境或培养基上才能生长。尿道分泌物细胞内外吞噬第30页，共81页，2023年，2月20日，星期三8.今天的培养结果怎么与前天的不一样？取材是否规范。痰标本，有时选优势菌做，就可能导致两次不一样。第31页，共81页，2023年，2月20日，星期三9.明显稀便，培养结果为何正常？大便普通培养，通常只能鉴定志贺菌、沙门菌感染。怀疑霍乱时，需开霍乱弧菌培养。可能病毒感染(轮状病毒、肠道病毒)。第32页，共81页，2023年，2月20日，星期三四、临床微生物标本的采集及运送（一）规范采集及运送标本的重要性第33页，共81页，2023年，2月20日，星期三

我们应该追求：

“准确的病原学诊断”

“针对性病原学治疗”

“有效预防医院感染”

正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！

微生物让人类步步为营，第34页，共81页，2023年，2月20日，星期三

检验误差发生率哪个阶段最高？第35页，共81页，2023年，2月20日，星期三

研究表明，60%以上实验误差发生在分析前，这也是检验质量管理中最难控制的部分。因此，获得准确结果的重要环节

分析前质量控制第36页，共81页，2023年，2月20日，星期三不合格标本带来的后果标本不合格结果不准确诊断错误治疗错误第37页，共81页，2023年，2月20日，星期三（二）微生物标本采集原则及时采集微生物标本作病原学检查在抗菌药物使用前采集标本采样时严格执行无菌操作采样后立即送检甚至床旁接种尤其是厌氧培养棉拭子标本要保持湿润，宜用运送培养基标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。送检标本应注明来源和检验目的第38页，共81页，2023年，2月20日，星期三最有价值的细菌学检测项目

血液培养脑脊液培养胆汁培养胸腹水培养关节液其他无菌体液或分泌液第39页，共81页，2023年，2月20日，星期三

标本的采集和选择的基本要求1.选择准确的解剖部位、合适的时间、适当的设备采集标本；2.采集足够量的标本，以保证检测的阳性率；

标本运送的基本要求1.所有常规性细菌学检验的标本需在采集后2h内送至微生物室，若延迟送检，应放于安全防护盒内；脑脊液应在15分钟内送到；2.尿液标本置于2-4℃冰箱保存不能超过24h；3.疑似苛养菌感染的标本立即保温送检。第40页，共81页，2023年，2月20日，星期三（三）各类临床微生物标本的采集

1.血培养标本的采集第41页，共81页，2023年，2月20日，星期三血培养是进行血流感诊断的最佳手段第42页，共81页，2023年，2月20日，星期三“只有在发热时，才需要进行血培养。”————关于血培养指征想采就采？第43页，共81页，2023年，2月20日，星期三血培养的指征临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者有：不明原因的发热(≥

38℃)或体温过低(≤

36℃)白细胞增多（＞

10×109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞增多）粒细胞减少（＜成熟的多核白细胞<1×109/L

）休克，寒颤，多器官衰竭严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎，腹部术后感染，…)，CRP升高第44页，共81页，2023年，2月20日，星期三

采集血培养样本的最佳时间尽可能在患者寒战或开始发热时采血在患者接受抗生素治疗前采血如患者已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次用药之前采血培养

第45页，共81页，2023年，2月20日，星期三血培养检测消毒程序

1.皮肤消毒程序：严格执行三步法（防止皮肤寄生菌污染）

（1）用75%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上；

（2）然后用1%-2%碘酊作用30秒或10%碘伏作用60秒，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上；（3）最后用75%酒精脱碘，待酒精挥发干燥后采血。

新生儿及对碘过敏的患者，只能用75%酒精消毒60s，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。

2.培养瓶消毒程序：

（1）用75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞，作用60秒。

（2）用无菌纱布或无菌棉签清除橡皮塞表面剩余的酒精，然后注入血液。

第46页，共81页，2023年，2月20日，星期三

关于采集血液量采血量是影响检出阳性率最关键因素成人一份标本2个培养瓶（需氧＋厌氧），每瓶8－10ml，共20ml；要求至少采两份标本，即40ml。儿童一般只需采集需氧瓶，在保证采集血量＜1％总血量下，一般为1－3ml。采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90％以上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染。

第47页，共81页，2023年，2月20日，星期三2.下呼吸道（痰培养）标本采集第48页，共81页，2023年，2月20日，星期三

病原体种类繁多而复杂

使下呼吸道感染病原诊断成为难题细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫第49页，共81页，2023年，2月20日，星期三咳痰途经口咽部唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。不可避免地受到污染第50页，共81页，2023年，2月20日，星期三

采集指征凡是发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，并伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音，外周白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎性浸润或胸腔积液，甚至出现感染性休克和呼吸衰竭等患者，应采集痰液或下呼吸道标本。对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。第51页，共81页，2023年，2月20日，星期三

我国痰培养现状标本送检率低苛养菌检出率极低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差距第52页，共81页，2023年，2月20日，星期三标本采集方法

（1）自然咳痰法

以晨痰为佳。用清水反复漱口，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌容器中，尽快送检。否则有的细菌（如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌）在外界可能死亡。（2）小儿取痰法用弯压舌板向后压舌，用棉拭子深入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部和气管分泌物，粘在棉拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。（3）支气管镜采集法

-经支气管镜直接吸引

-支气管肺泡灌洗

-防污染样本毛刷第53页，共81页，2023年，2月20日，星期三医师或护士直视下采集标本病人先漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液临床上约半数咳痰标本不合格！第54页，共81页，2023年，2月20日，星期三合格标本的判断标准外观：观察颜色、粘度、有无血丝或脓。若标本为水状且很明显是唾液，则应拒收。为了判定是否来自下呼吸道的痰，需检查是否为合格的痰标本。一般认为来自下呼吸道的合格标本应该是含脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受唾液污染的来自于颊黏膜的扁平上皮细胞较少，其判定标准如下表：第55页，共81页，2023年，2月20日，星期三A、B级的痰标本适合进行培养；C、D级的标本须高倍镜镜下观察区分，根据视野内的白细胞或纤毛柱状上皮细胞的数量，以及细菌的种类及分布等结果进行判定；E级为不合格标本。分级白细胞（个）/LP扁平上皮细胞（个）/LPA＞25＜10B＞2510-25C＞25＞25D10-25＞25E＜10＞25第56页，共81页，2023年，2月20日，星期三合格痰液标本不合格痰液标本第57页，共81页，2023年，2月20日，星期三

3.尿培养标本采集规范第58页，共81页，2023年，2月20日，星期三正常人尿液是无菌的，而尿液细菌培养最大的问题是杂菌污染。正常人外尿道有大肠杆菌、葡萄球菌等存在。而这些细菌又是尿路感染中常见的病原菌。因此要作好尿液细菌学检查，首先应注意标本收集问题。尿液经尿道排出时会受到尿道内正常菌群的污染,但定量培养时计数不会超过103CFU/ml,泌尿系感染时定量培养在104～105CFU/ml

。另外,由于绝大多数的泌尿系感染是由肠杆菌科细菌引起,而此类细菌的硝酸盐还原实验为阳性,故可参考尿检查常规中的硝酸盐还原实验来推断是否有细菌感染。第59页，共81页，2023年，2月20日，星期三

送检指征有典型的尿路感染症状；有肉眼脓尿或血尿；尿常规检查白细胞或亚硝酸盐阳性；有不明原因的发热，无其他局部症状；留置导尿管的患者出现发热；膀胱排空功能受损；泌尿系统疾病手术前；有尿路感染症状者，前次培养结果阴性或抗菌治疗48h后仍持续发热。抗生素停药后，感染症状再次出现。第60页，共81页，2023年，2月20日，星期三

尿培养标本采集方法标本采集应在使用抗生素之前，避免消毒剂污染标本。清洁中段尿留取清晨清洁中段尿标本，先用肥皂水仔细清洗会阴部，再用清水冲洗尿道口周围；将前段尿排去，留取中段尿10ml左右于无菌容器内，立即加盖送检，2h内接种。该方法简单、易行，是最常用的尿标本收集方法，但是容易受到会阴部细菌污染。耻骨上膀胱穿刺使用无菌注射器直接从耻骨上经皮肤消毒穿入膀胱吸取尿液，是评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法，主要用于厌氧菌培养或留取标本困难的婴儿尿标本的采集。第61页，共81页，2023年，2月20日，星期三直接导尿按常规方法对会阴局部进行消毒后，用导尿管直接经尿道插入膀胱，获取膀胱尿液，可减少尿液标本污染，准确地反映膀胱感染情况。但有可能下尿道细菌进入膀胱，导致继发感染，一般不提倡使用。小儿收集包无自控能力的小儿可用收集包收集尿液，这种装置由于很难避免会阴部菌群污染产生假阳性，所以只有在检验结果为阴性时才有意义。如果检验结果为阳性，应结合临床进行分析，必要时可使用膀胱上穿刺或导尿法留取标本进行复检。留置导尿管收集尿液用导尿管导取10-15ml尿液置灭菌容器内送检。长期留置导尿管者，应在更换新导尿管后留取尿标本。留置导尿患者应消毒导尿管外部及尿管口，采取无菌操作方法，用注射器通过导尿管吸取尿液。注意防止混入消毒剂，不能从尿液收集袋中采集尿液。第62页，共81页，2023年，2月20日，星期三

注意事项

由于自然排尿收集的标本很难避免会阴部及下尿道细菌污染，所以需要定量接种、合理评价才能判断培养的细菌是否与尿路感染有关。尿标本菌落计数中革兰阴性杆菌数>105CFU/ml或革兰阳性球菌数>104CFU/ml时有临床诊断意义。（不是绝对的，受多因素影响，综合判断）

尿液标本的采集和培养中的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作。

尿标本采集后应立即送检，以免污染，尿液中不得加防腐剂和消毒剂。第63页，共81页，2023年，2月20日，星期三除非是流行病学调查，长期留置导尿管患者常规尿培养没有临床意义，大量病原菌常可在这类患者中检出，导尿管留置时间延长易导致与引起患者尿道感染不一致的微生物定植生长；不可从集尿袋的下端管口留取标本，集尿袋内的尿液也不能用于培养，可能会引起污染；临床常让患者留取清洁中段尿，应该在医护人员监督指导下让患者正确的留取清洁中段尿；由于种种原因，患者常常不能正确地留取清洁中段尿，实验室只是针对尿液标本培养的结果进行评估，或常常由于分析前尿液标本污染了多种细菌无法正确解释的结果，可能延误了临床的正确诊断和治疗。第64页，共81页，2023年，2月20日，星期三

4.大便培养标本采集规范第65页，共81页，2023年，2月20日，星期三

采集时间腹泻患者应在急性期，并尽可能在使用抗生素之前采集新鲜粪便；伤寒患者在发病2周以后。

采集方法自然排便采集法自然排便后，挑取有脓血或黏液部位的粪便2-3g，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内或置于保存液或增菌液中送检。直肠拭子采集法对不易获得粪便或排便困难的患者及婴幼儿，可采用直肠拭子法采集标本，其方法是将拭子前端用甘油湿润。然后插入肛门约4～5cm（幼儿约2～3cm）处，轻轻在直肠内旋转，擦取直肠表面粘液后取出，盛入无菌试管或保存液中送检。第66页，共81页，2023年，2月20日，星期三实验室检查肠道细菌大多为革兰阴性杆菌，且因粪便标本中有各种正常菌群，形态上区分困难，因此一般不做直接涂片检查。只有当临床怀疑肠道菌群失调或检查霍乱弧菌、结核分枝杆菌、疑似葡萄球菌或难辩梭菌引起的伪膜性肠炎以及真菌性腹泻时，才做直接涂片检查。疑似葡萄球菌引起的抗菌素相关性肠炎，可取水样便或肠黏膜样物涂片，革兰染色后镜检，见革兰阴性杆菌明显减少，革兰阳性球菌大量散在或成堆（葡萄状）排列，可提示肠道菌群失调。第67页，共81页，2023年，2月20日，星期三注意事项在腹泻发病的正确时间收集标本，病人应尽量在急性期（3d）内和用药前采集标本，以提高检出率。大便标本中含有很多杂菌，粪便标本的采集须注意防止外界脏物污染，尽量采用无菌容器。为提高阳性检出率，要采集新鲜标本，立即送检。第68页，共81页，2023年，2月20日，星期三

5、穿刺液标本采集规范第69页，共81页，2023年，2月20日，星期三

穿刺液主要包括:

脑脊液

胆汁

胸水

腹水

心包液

关节液

鞘膜液

在正常人体中，上述体液均是无菌的。有感染的情况下检出的细菌，在排除污染后应视为病原菌，及时给予正确的治疗，使病人早日恢复健康。第70页，共81页，2023年，2月20日，星期三

送检指征

脑脊液：症状指征：发热等感染性全身症状、颅内压升高、脑膜刺激症状、神经麻痹症状、脑脊液常规及生化变化；怀疑脑膜炎时。胸水：多伴有胸痛、发热、胸腔积液；疑似胸膜炎、胸腔积水；腹水：有积液伴腹痛、呕吐、肌紧张、肠鸣音弱或消失等。疑似原发或继发性腹膜炎；胆汁：腹痛、黄疸、右上腹压痛、肌紧张、胆囊区深吸气时有触痛；疑似胆石症、胆囊炎、肝胆系统感染等。心包液：发冷、发热、心悸、出汗、乏力及精神症状；心前区疼痛、心包摩擦音、心音明显减弱、心电图改变等。疑似心包炎；关节液：关节肿胀，关节周围肌肉发生保护性痉挛；疑似化脓性关节炎。第71页，共81页，2023年，2月20日，星期三

脑脊液

采集时间：怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，最好在使用抗菌药物以前采集标本。

采集方法：

用腰穿方法采集脑脊液3～5ml，分装到3个无菌试管中，每个试管1～2ml。第一管用于细菌培养!

也可将抽取液直接注入血培养瓶,用血培养仪培养。

标本运送和保存：

脑膜炎奈瑟菌离体后会迅速自溶,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌也很容易死亡,因此,标本应立即送检,并注意保温、防干燥。切不可置冰箱保存,否则会影响检出率。脑脊液标本送检的理想时间为15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过1小时，则会影响结果。如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶）。由于培养瓶中含有的聚茴香胺硫酸钠（SPS）对脑膜炎奈瑟菌有毒性。第72页，共81页，2023年，2月20日，星期三新型隐球菌墨汁负染色左图：低倍镜；右图：高倍镜第73页，共81页，2023年，2月20日，星期三

胆汁及其它穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等）

采集时间怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后2-3天采集。

采集方法①无菌操作穿刺抽取标本或外科手术采集标本。②标本采集量应＞1ml。胸腔积液、腹水可抽取10ml,心包液、关节液等可抽取2～5ml。③标本采集后注入无菌小瓶或无菌试管中送检也可将抽取液直接注入血培养瓶，用血培养仪培养。为防止穿刺液的凝固，