酶的分离纯化课件

第六节层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个相是固定的,称为固定相;另一个相是流动的,称为流动相;各组分移动速度步同,使不同组分分纯化;层析分离设备简单,操作容易;层析分离层析柱表4-5层析分离方法层析方法分离依据吸附层析吸附力不同分配层析各组分在两相中分配系数不同离子交换层析离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同凝胶层析各组分相对分子量不同亲和层析生物分子与配基间专一又可逆亲和力层析聚焦等电特性与离子交换层析特性结合一、吸附层析一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附；利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）。不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。吸附层析法:利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离。（液-固色谱法，LSC）吸附层析原理二、分配层析分配层析法（液-液层析法，LLC）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。三、离子交换层析原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。酶是两性物质，当溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。用于酶分离纯化的常用离子交换剂离子交换树脂：大孔径离子交换树脂。离子交换纤维素：DEAE-纤维素，AE-纤维素，CMC（羧甲基纤维素）离子交换凝胶：DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶等。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。1、离子交换剂的处理与装柱；2、上柱；3、冼脱和收集；4、离子交换剂的再生。２、离子交换层析的主要操作过程１、离子交换剂的选择与处理是含有若干活性基团的不溶性高分子物质；引入不溶性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；平衡常数Ｋ；（１）离子交换剂的选择；（２）离子交换剂的处理。back四、凝胶层析概念（排阻层析，分子筛层析）：混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶层析是60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析柱使用。设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。凝胶颗粒１、凝胶层析的基本原理凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱;分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。Kd：分配系数，Kd小的物质先流出。Ve：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。Vo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积Vi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。表征式讨论Kd=1Kd=00<Kd<1Ve=V0,组分足够大,不进入胶粒微孔,最先流出Ve=V0+Vi,可自由扩散,最后流出Kd小的先流出,Kd大的后流出1、交联葡聚糖凝胶：以葡聚糖为单体聚合而成的高分子聚合物。商品名为Sephader，从G-10到G-200共有8种型号。

1)SephadexGG后的数字为凝胶吸水值的10倍。

G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质2、琼脂糖凝胶：商品名为Sepharose（瑞典）Bib-gelABlo-Rad（美国）Gelarose（丹麦）。

依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。3、聚丙烯酰胺凝胶：商品名为生物胶—PBio-gelP。人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。4、聚丙乙烯凝胶（Styrogel)大网孔结构。２、凝胶的选择与处理３、凝胶层析操作过程加入的酶液量为凝胶床体积的10%左右，不超过30%；冼脱液体积为凝胶床体积的120%左右；冼脱液与干胶溶涨和装柱平衡用液相同。１、亲和层析母体和配体配基母体样品样品配基(ligand)作为固定相（成对互配生物分子的任何一方）的一方；母体（载体、担体）(matrix)不溶性，常用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。机理图有兩大类力量，构成分子之间的专一性吸引力。一是兩个分子之间，其构形有如积木般的互补，会因为范德华力的关系，产生专一性吸引力;另一則为两分子之间，因为某些基团间产生了二級鍵，所造成的吸引力。第七节电泳分离定义:electrophoresis带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。电泳的基本原理原理:不同的物质，由于其带电性质及颗粒大小和形状不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不相同，因此可使它们分离。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。+-酸碱中F>0F=0H+H+OH-迁移原理图用途（酶工程领域）酶的纯度鉴定;酶分子量测定;酶等电点测定;小批量酶的分离纯化.水平电泳仪垂直电泳槽四、凝胶电泳垂直管型盘状电泳；垂直板型电泳。定义以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支撑物（通常是聚丙烯酰胺凝胶）的电泳技术。形状單面垂直電泳槽胶膜放入底座胶膜固定在底座上

加胶放电梳

制胶完成取出

放入电泳槽中

安裝防护罩整套安裝完毕准备电泳

制胶图示Back凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为：T=C=

凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%在浓度为7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5%凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。back不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

3.在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高.8.38.38.96.7凝胶层由上至下分别为：样品胶、浓缩胶、分离胶样品胶包含样品的大孔径凝胶浓缩胶用于样品浓缩成导线的大孔径凝胶，不含样品，其它与样品胶一样分离胶使样品中各组分电泳分离的孔径较小的凝胶backSDS-凝胶电泳在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入1~2%的SDS（十二烷基硫酸钠）而成。1967，Shapiro等发现。前述的凝胶电泳中，迁移率主要取决于蛋白电荷及分子大小及形状；SDS-凝胶电泳中，电泳迁移率取决于蛋白分子量大小，而与其分子形状及其所带电荷无关，故该方法主要用于测定蛋白质或酶的分子量。两种不同形式的电泳为什么SDS-凝胶电泳会不受蛋白分子所带电荷及分子形状影响呢？SDS阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上结合大量阴离子掩盖了蛋白质间原来的电荷差别；SDS与蛋白结合后引起蛋白质构象变化，在水溶液中变成长椭圆形，短轴均为18A，长轴与蛋白分子量成正比。五、等电聚焦电泳IEF在电泳系统中加入两性电解质载体（在电场中能够形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度），当不同蛋白质等进入该体系中即移动（聚焦）到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。IEF原理pH连续增高pI点（1）分辩率高（等电点仅差0.01~0.02pH）；（2）防止扩散；（3）不管加样部位；（4）样品稀，重现性好；（5）测定等电点准确。等电聚焦电泳显著特点等电聚焦电泳缺点（1）要求无盐溶液，会产生沉淀；（2）对在等电点时溶解度低的组分不适。附：酶的组合分离纯化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）设计分离纯化工艺的基本要求

在实践工作中选择方法时:首先应对被纯化的酶的理化性质(如溶解度、分子量大小、稳定性和解离时电学性质等)有—个比较全面的了解，这样，就可以知道在分离纯化时可以选用那些方法和条件，避免哪些处理，从而得到好的纯化效果;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶活性为标准。一个好的方法和条件是比活力提高得多，总活力回收多，而从重复件好;在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件。因为这样不能使纯度进一步提高，而只能使酶的总活力下降。再者要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之