电子显微镜是根据电子光学原理

电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示。20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米（人眼的分辨本领约为0.1毫米）。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。1931年，德国的克诺尔和鲁斯卡，用冷阴极放电电子源和三个电子透镜改装了一台高压示波器，并获得了放大十几倍的图象，证实了电子显微镜放大成像的可能性。1932年，经过鲁斯卡的改进，电子显微镜的分辨能力达到了50纳米，约为当时光学显微镜分辨本领的十倍，于是电子显微镜开始受到人们的重视。到了二十世纪40年代，美国的希尔用消像散器补偿电子透镜的旋转不对称性，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代水平。在中国，1958年研制成功透射式电子显微镜，其分辨本领为3纳米，1979年又制成分辨本领为0.3纳米的大型电子显微镜。电子显微镜的分辨本领虽已远胜于光学显微镜，但电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。其他的问题，如电子枪亮度和电子透镜质量的提高等问题也有待继续研究。分辨能力是电子显微镜的重要指标，它与透过样品的电子束入射锥角和波长有关。可见光的波长约为300〜700纳米，而电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50〜100千伏时，电子束波长约为0.0053〜0.0037纳米。由于电子束的波长远远小于可见光的波长，所以即使电子束的锥角仅为光学显微镜的1%，电子显微镜的分辨本领仍远远优于光学显微镜。电子显微镜由镜筒、真空系统和电源柜三部分组成。镜筒主要有电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体；真空系统由机械真空泵、扩散泵和真空阀门等构成，并通过抽气管道与镜筒相联接；电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。电子透镜是电子显微镜镜筒中最重要的部件，它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦，其作用与玻璃凸透镜使光束聚焦的作用相似，所以称为电子透镜。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子枪是由钨丝热阴极、栅极和阴极构成的部件。它能发射并形成速度均匀的电子束，所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌，也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合，构成电子微探针，用于物质成分分析；发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。投射式电子显微镜因电子束穿透样品后，再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿。在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。样品较薄或密度较低的部分，电子束散射较少，这样就有较多的电子通过物镜光栏，参与成像，在图像中显得较亮。反之，样品中较厚或较密的部分，在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密，则像的对比度就会恶化，甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。透射式电子显微镜镜筒的顶部是电子枪，电子由钨丝热阴极发射出、通过第一，第二两个聚光镜使电子束聚焦。电子束通过样品后由物镜成像于中间镜上，再通过中间镜和投影镜逐级放大，成像于荧光屏或照相干版上。中间镜主要通过对励磁电流的调节，放大倍数可从几十倍连续地变化到几十万倍；改变中间镜的焦距，即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。为了能研究较厚的金属切片样品，法国杜洛斯电子光学实验室研制出加速电压为3500千伏的超高压电子显微镜。扫描式电子显微镜结构示意图扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品，仅在样品表面扫描激发出次级电子。放在样品旁的闪烁晶体接收这些次级电子，通过放大后调制显像管的电子束强度，从而改变显像管荧光屏上的亮度。显像管的偏转线圈与样品表面上的电子束保持同步扫描，这样显像管的荧光屏就显示出样品表面的形貌图像，这与工业电视机的工作原理相类似。扫描式电子显微镜的分辨率主要决定于样品表面上电子束的直径。放大倍数是显像管上扫描幅度与样品上扫描幅度之比，可从几十倍连续地变化到几十万倍。扫描式电子显微镜不需要很薄的样品；图像有很强的立体感；能利用电子束与物质相互作用而产生的次级电子、吸收电子和X射线等信息分析物质成分。扫描式电子显微镜的电子枪和聚光镜与透射式电子显微镜的大致相同，但是为了使电子束更细，在聚光镜下又增加了物镜和消像散器，在物镜内部还装有两组互相垂直的扫描线圈。物镜下面的样品室内装有可以移动、转动和倾斜的样品台。传统显微镜成本高昂，如果想要连接电脑示像则需要复杂的转接结构，总价格是家庭用户所无法接受的。爱国者数码观测王GE-5就是为了解决成本和易用性出现的新型产品，对于学校、家庭这类教育环境使用的显微镜，用户可能并不需要极高的放大倍数，也不需要非常精密的调节功能，而是需要售价低廉、使用方便的产品，爱国者数码观测王GE-5是目前国内市场能够购买到的唯一一款低价入门级电子显微镜，整个操作过程依赖于电脑端，可以直接打印、录像和抓图，方便输出分享优点：1、成本低、易用性更高的解决方案2、成像质量较高3、提供多种光源供选择，并且支持独立操作缺点：1、长时间运行后CMOS较热，对成像有一定影响:分扫描电镜和透射电镜都要经过专门培训的专业人员才可以使用一般学校科研机构都有专门人员负责管理和使用一般人要使用不能直接操作，只能把待观察样品做好送去让专业人员操作电子显微镜不是普通光学显微镜，不是照着说明书做就可以的了需要很多的经验才能用得好请问场发射扫描电子显微镜与普通扫描电镜相比有哪些两者原理，或结构上的区别；分辨率方面的区别；优点等二次电子象分辨率：1.5nm加速电压：0〜30kV放大倍数：10-50万倍连续可调工作距离：5〜35mm连续可调倾斜：-5°〜45°x射线能谱仪：分辨率：133eV分析范围：B-U1.流式细胞仪的工作原理：借鉴了荧光显微镜技术，将激发光改为激光，使具有更好的单色性；利用荧光染料与单克隆抗体技术，提高特异性与灵敏度；将固定的标本台改为流动的单细胞悬液，并用计算机进行信号的数据处理分析，能同时从一个细胞上获得多种参数资料。2.鞘液的主要作用：鞘液是辅助样本流进行正常检测的基质液，其主要作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测精确性，同时防止样本流中细胞靠近孔壁而堵塞喷嘴。3.流式细胞仪荧光测量的基本原理：荧光测量时，荧光信号由被测细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后产生特定波长荧光与颜色，通过波长选择通透性滤光片，将不同波长荧光信号区分开，送到不同的光电倍增管，经过一系列信号转换、放大、数字处理，可在计算机上显示出来。4.细胞分选的原理：当细胞悬液形成液流柱流经流动室，流动室上方的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使液流柱断裂成一连串均匀的液滴，其形成速率约每秒3万个，其中仅少数液滴含有细胞，大量为不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会充电，带有正或负电荷，未设分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电液滴在落入电极偏转极的高压静电场，依所带电荷是正或负而发生向右或左道偏转，落入指定收集器中完成分选。5.同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整及设置电流电压，在此基础上进行样本检测可使荧光标记单抗的信号保持特异性，如不用同型对照，结果的可靠性将受到影响。六、论述题1.用流式细胞仪进行细胞分选的技术要求有：分选速度，一般要求分选速度达5000个/秒左右，以保证被分选细胞的生物活性不受影响。分选速度与仪器性能有关，与细胞悬液中被分选细胞含量呈正相关。分选速度应按细胞的特性决定，如培养细胞因其膜脆弱，不宜选择高速;而骨髓来源的细胞因所占比例不变，宜选高速。②分选纯度，与仪器精密度及被选细胞与其他细胞有无重叠特性相关，也与实验设计的选择密切相关。③分选收获率，即通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞的比例，同样与不选细胞有否重叠相关。收获率与纯度有对应关系：要求纯度高，收获率相对低；要求收获率高，则纯度相对降低。实际工作中，应在不影响纯度的情况下，获得最高收获率。④分选得率，是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。得率与分选速度相关，分选速度过高，会有部分目的细胞漏检，得率下降；分选速度降低，得率增加。2.制备合格单细胞悬液时应注意：采用适当的制备方式，应保证检材的新鲜，分离单核淋巴细胞洗涤离心去除细胞碎片，洗涤时避免高速离心而致细胞膜结构损伤。有些患者在标本的分离过程中，会出现红细胞粘附现象，此时使用溶血剂处理红细胞比地势低渗液更有利淋巴细胞膜不受破坏。实体组织标本制备单细胞悬液，最好采用机械法，因化学法与酶法都易造成细胞碎片增加、细胞膜结构或抗原的损伤，而机械法中控制机械用力强度是关键。温度与PH，在处理洗涤细胞时，溶液温度应在25°C~37°C之间，PH在7.0~7.2之间，以维持细胞与体内的生理条件相似,不致发生细胞形态与结构的改变.流式细胞仪在血液病检测中的应用：对淋巴细胞表面抗原进行连续检测可明确淋巴细胞分化过程中各阶段表面抗原的表达，并检出异常表型的淋巴细胞，它们往往是恶性肿瘤细胞，如恶性淋巴瘤的典型特征是单一表型的单克隆淋巴细胞群。利用单克隆抗体也可对白血病细胞进行免疫分型，并对异向性治疗和预后判断提供帮助，FCM可同时测定细胞膜抗原、胞质抗原和DNA含量，有助于血液系统恶性疾病的检测、治疗和预后分析。白血病的准确分类是选择化疗方案和判断预后的主要依据，FCM结合单抗的应用可提高白血病分类诊断符合率，并分期；可对慢性粒细胞性白血病急性发作时的主要病变细胞进行分析，对白血病复发的主要根源一微小残留病变的检出有高特异性和敏感性，故在缓解期患者检测微小残留病变以避免复发。激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。二基本原理：传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。三.应用范围：细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析药理学：药物对细胞的作用及其动力学生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断；四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用A.在细胞及分子生物学中的应用1,细胞、组织的三