微生物检验项目性能验证

Com.30550：Instrument/EquipmentPerformanceVerification

Theperformanceofallinstrumentsandequipmentisverifieduponinstallationandaftermajormaintenanceorservicetoensurethattheyrunaccordingtoexpectations.2015/07/28仪器/设备性能验证

所有仪器和设备在安装后以及重要维护保养服务后应进行性能验证，以确保其可以按照预期运行。

NOTE：Performanceverificationisnecessaryafterrepairsorreplacementofcriticalcomponentsofaninstrumentoritemofequipment.

维修或更换仪器，或者更换仪器关键部件后必须进行性能验证Why？第一页，共57页。CNAS-CL042：5.5.1.2:

新的鉴定系统使用前，应查阅已发表的完整、科学的系统评估文献作为性能验证的初级证据，再按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果的符合性进行验证。CNAS-CL042：5.3.1.5

如果设备故障影响了方法学性能，在设备修复、校准后，实验室可通过检测质控菌株或已知结果的样品的方式进行性能验证。why第二页，共57页。CNAS-GL41：临床微生物检验程序验证指南，

在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。2016/5/30why第三页，共57页。微生物检验程序包括：显微镜检查、分离培养和鉴定、药物敏感试验，血清学检查，抗原检查等各项检验活动，第四页，共57页。实验室应根据分析类型和用途进行验证程序的设计、验证结果的统计学分析、建立新检验程序的可接受性能标准。验证结果应证明该检验程序可用于检测或准确分析待测物的特点，通常验证计划和可接受标准应在验证开始前确定。

CNAS-GL41:4.2第五页，共57页。验证计划和可接受标准应与该分析物相关的国家/行业标准/权威出版物等保持一致。定义可接受标准的方法之一是根据医学和临床要求确定总允许误差，但通常应用于定量检测。定性检测的可接受标准可以用一致性（符合率）表达。CNAS-GL41:4.2第六页，共57页。检验程序验证所使用的标本应为合格的临床标本或从回顾性/前瞻性临床标本中分离的菌株。标本的采集应符合国家、地区法规要求。已通过一种或多种方式确定性能的标准菌株或质控品（如国家或地方临床检验中心使用过的质控菌株）也适用。

标本CNAS-GL41:4.2第七页，共57页。显微镜检查

CNAS-GL41:4.3

第八页，共57页。涂片制备染色镜检

染色方法包括手工染片和自动化仪器染片结果报告应在检验项目开展前进行性能验证，并由有经验的实验人员操作所有样品及容器应当作具有传染性的物质，应按照实验室生物安全要求进行操作。显微镜检查CNAS-GL41:4.3第九页，共57页。

包括能力验证/实验室间比对，实验室内人员比对,

实验室如果开展手工染片和自动化染片，应该对两种方法进行实验室内比对。

验证要求CNAS-GL41:4.3第十页，共57页。样品数量

1.每项检查至少5份样本

2.需覆盖全部样本类型

3.无菌样本类型应包含阳性和阴性结果

4.应优先选择使用已知结果的留样样本，不可获取时采用模拟样本

比对方案CNAS-GL41:4.3第十一页，共57页。按照临床标本常用检验方式处理，由工作人员进行操作进行手工染片和自动化仪器染片时涂片需同时制备两份进行实验室间比对和能力验证时，需由当日在岗人员进行涂片，染色，镜检，结果报告进行实验室内人员比对时，由本岗位人员负责制片，染色，所有从事显微镜检查的人员进行镜检，结果报告，由专人进行结果统计。

比对方案CNAS-GL41:4.3第十二页，共57页。结果报告

根据实验室程序文件规定进行结果报告。抗酸染色按照要求进行分级报告。可接受标准每项检查结果符合率≥80%。

比对方案CNAS-GL41:4.3第十三页，共57页。

菌株或标本手工染色结果机染结果试验符合情况标准菌株大肠埃希菌ATCC25922红色红色符合流感嗜血杆菌CMCC58534红色红色符合金黄色葡萄球菌ATCC25923紫色紫色符合肺炎链球菌CMCC31533紫色紫色符合白色念珠菌ATCC14053紫色紫色符合混合菌明显区分明显区分符合临床菌株粪肠球菌紫色紫色符合屎肠球菌紫色紫色符合金黄色葡萄球菌紫色紫色符合表皮葡萄球菌紫色紫色符合无乳链球菌紫色紫色符合阴沟肠杆菌红色红色符合鲍曼不动杆菌红色红色符合肺炎克雷伯菌红色红色符合铜绿假单胞菌红色红色符合嗜麦芽窄食单胞菌红色红色符合光滑念珠菌紫色紫色符合近平滑念珠菌紫色紫色符合热带念珠菌紫色紫色符合新型隐球菌紫色紫色符合白色念珠菌紫色紫色符合临床标本痰1明显区分明显区分符合痰2明显区分明显区分符合痰3明显区分明显区分符合痰4明显区分明显区分符合痰5明显区分明显区分符合血及无菌体液1明显区分明显区分符合血及无菌体液2明显区分明显区分符合血及无菌体液3明显区分明显区分符合血及无菌体液4明显区分明显区分符合血及无菌体液5明显区分明显区分符合分泌物1明显区分明显区分符合分泌物2明显区分明显区分符合分泌物3明显区分明显区分符合分泌物4明显区分明显区分符合分泌物5明显区分明显区分符合粪便1明显区分明显区分符合粪便2明显区分明显区分符合粪便3明显区分明显区分符合粪便4明显区分明显区分符合粪便5明显区分明显区分符合第十四页，共57页。一般培养（非血液标本）

第十五页，共57页。一般培养包括各类标本的细菌、真菌、支原体的培养。标本类型包括痰液、尿液、粪便、分泌物、组织等细菌包括厌氧菌和分枝杆菌等培养程序包括标本处理、接种、培养基选择、培养条件选择等

一般培养第十六页，共57页。每项检查，每种样本至少1份标本无论商品化培养基还是自配培养基，都需要在使用前对培养基性能进行验证，验证菌株可选择质控菌株或临床菌株。标准菌株、能力验证/室间质评活动使用的菌株、从临床病人标本分离的具有稳定表型的菌株均可用做验证菌株，实验室对其生化特征及鉴定结果应做好相关记录。

验证要求第十七页，共57页。直接接种法

按照实验室细菌分离培养的SOP，将待测标本接种到相应的培养基上，观察菌落生长情况。

注意：在直接接种法验证不合格的情况下要采用标准化菌悬液进行验证。

验证方案第十八页，共57页。标准化菌悬液法

1.菌悬液制备

1）直接菌落法：挑取培养18-24h的菌落，在生理盐水中制备成0.5Mcf的菌悬液

2）生长法：从培养24h的培养物中挑取3-5个菌落至无菌肉汤中，孵育数小时使其达到0.5Mcf

验证方案第十九页，共57页。标准化菌悬液法

2.接种

1）验证非选择培养基

用无菌肉汤或生理盐水将配置好的菌悬液进行1:100稀释，每个平板接种10uL，均匀涂布接种。如生长过密则进行1:1000稀释

2）验证选择性培养基

用无菌肉汤或生理盐水将配置好的菌悬液进行1:10稀释，每个平板接种10uL，均匀涂布接种。如生长过密则进行1:100稀释

3）验证培养管

用10uL未经稀释的菌悬液进行接种。

验证方案第二十页，共57页。在选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典型，并且能够抑制特定微生物的生长，可判定性能符合要求，验证合格。在非选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典型，血培养基上的溶血类型符合，可判定非选择性培养基验证合格。

可接受标准第二十一页，共57页。血培养CNAS-GL41:4.4.1第二十二页，共57页。临床微生物室血培养系统验证的目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物，以及仪器是否能及时检测出血液中大部分的微生物。

第二十三页，共57页。血培养性能验证常用留样验证和血培养系统平行比对两种方法。本实验室采用的是留样验证的方法，操作过程参照《XJ-SOP-006细菌室检验项目性能验证》

第二十四页，共57页。验证应覆盖临床常见微生物需氧成人/儿童血培养瓶验证菌株应包括:需氧/兼性厌氧革兰阳性菌、需氧/兼性厌氧革兰阴性菌、苛养菌（如：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等）和真菌，厌氧血培养瓶验证菌株应包括兼性厌氧革兰阳性菌、兼性厌氧革兰阴性菌、专性厌氧菌，其他特殊用途血培养瓶参照厂家要求选择合适类型菌株进行验证。

验证要求第二十五页，共57页。每种类型至少１株，总体不少于15株。应尽可能使用真实患者的临床分离菌株（性能验证用临床留样菌株宜经质谱或DNA序列分析确认）。对于特殊、苛养菌可使用标准菌株或质控菌株。某些特殊菌株需要在培养瓶中加入无菌、未使用抗生素的厂家推荐血液标本，如不加可能不生长，如流感嗜血杆菌。验证要求第二十六页，共57页。模拟临床血流感染患者的细菌含量。若苛养菌需添加适量的新鲜无菌血液（成人瓶5-10ml，儿童瓶1-3ml）后置于血培养系统上进行培养、检测。验证方案第二十七页，共57页。挑取培养18-24h的新鲜培养物，在生理盐水中调整为0.5麦氏浊度的菌悬液，然后倍比稀释。如图所示验证方案0.5Mcf~108CFU/ml0.5ml0.5ml0.5ml~106CFU/ml~104CFU/ml~102CFU/ml0.5ml

#4~10CFU/ml第二十八页，共57页。从#4号试管里取3ml菌悬液注入血培养瓶内，同时取1ml菌悬液在平板上进行涂布接种，确认接种数量。将接种好的血培养瓶放入仪器进行监测，待阳性报警后移种平板，涂片染色，确认是否为接种菌验证方案第二十九页，共57页。在厂家说明书规定时间内检测出所有菌株则该方法通过验证。3天时间应足以检测出至少95%的临床相关细菌，须具备苛养菌、真菌、厌氧菌等的检出能力。若未能检出应使用相同菌株进行重复试验来验证。若仍不能检测，实验室和/或制造商应在临床使用该系统前采取纠正措施。可接受标准第三十页，共57页。如果血培养仪升级，原系统和新系统的差别不大，使用的培养瓶也没有改变，那么由供应商技术代表核查仪器性能即可，无需再次验证。功能核查将对孵育系统和光学系统以及软件是否按照制造商规定运行进行评价。可接受标准第三十一页，共57页。菌株BacTAlert3DBECTECFX时间差需氧培养瓶批号1041828需氧培养瓶批号5155951培养瓶条形码报阳时间h培养瓶条形码报阳时间h白色念珠菌SFP11B2S22.44492285184217.145.26铜绿假单胞菌SFP11B4216.5644922895182212.124.44大肠埃希菌SFP11B2816.084492289518169.776.31肺炎链球菌SFP11B1N16.8044922895180119.012.21甲型副伤寒沙门菌SFP11B2N14.8844922895180813.271.61金黄色葡萄球菌SFP11B3918.9644922895181814.954.01流感嗜血杆菌SFP11C6420.6444922895185012.757.89屎肠球菌SFP11C5719.244922895183714.085.12表皮葡萄球菌SFP11B2018.044922895179926.678.67肺炎克雷伯菌SFP11B2410.84492289517799.781.02鲍曼不动杆菌SFP11B4B20.444922895179712.278.13咽峡炎链球菌SFP11C7F24.9644922895183428.173.21脑膜炎奈瑟菌SFNW05CR25.4444922895178523.082.36嗜麦芽窄食单胞菌SFNW0C6D23.2844922895179216.756.53新型隐球菌SFNW0C6S30.9944922895180534.072.18阴性对照SFP1FXGN5d-4492292788375d-0第三十二页，共57页。第三十三页，共57页。微生物鉴定试验CNAS-GL41:4.5第三十四页，共57页。按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株，试验应覆盖实验室使用的全部卡片种类和/或方法。验证要求CNAS-GL41:4.5第三十五页，共57页。菌株种类的选择：

首先参照厂商说明书，覆盖革兰阳性和革兰阴性非苛养菌、苛养菌、厌氧菌、念珠菌、隐球菌等。包括临床留样菌株和标准/质控菌株。每种类型应至少1株，总体不少于20株。参照实验室SOP规定对验证菌株进行检测，一般要求鉴定至种水平。对于特殊类型的微生物（如棒状杆菌、厌氧菌，芽孢杆菌），可将鉴定到属的水平作为可以接受的性能标准。验证方案CNAS-GL41:4.5第三十六页，共57页。标准/质控菌株符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90％以上。可接受标准CNAS-GL41:4.5第三十七页，共57页。本实验室采用了连续20天检测待测菌株的方法进行了鉴定仪的性能验证试验。一共选取了26株细菌和真菌，参照标准操作规程《XJ-SOP-503VITEK2Compact标准操作规程》连续测试20天。GP、GN：如果失控的生化鉴定项目≤3个，可认为性能好可接受；如果质控检测结果和目标反应结果出现误差大于3个，必须立即进行查误步骤，如误差无法解决，则联系生物梅里埃/委托代理的技术代表。第三十八页，共57页。细菌名1234567891011121314151617181920金黄色葡萄球菌ATCC25923√√√√√√√√√√√√√√√√√√√-金黄色葡萄球菌WSB1403√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√鹑鸡肠球菌ATCC700327√√√√√√√√-√√√√√√√√√√√肺炎链球菌WSB1405√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√A群链球菌WSB1408√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√粪肠球菌ATCC29212√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√金黄色葡萄球菌ATCC29213√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√铜绿假单胞菌WSB1410√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√阴沟肠杆菌ATCC700323√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√嗜麦芽窄食单胞菌ATCC17666√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√肺炎克雷伯菌ATCC700603√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√福氏志贺菌CMCC12022√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√肠炎沙门菌WSB1402√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√鲍曼不动杆菌2014-809√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√洋葱伯克霍尔德菌2014-639√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√粘质沙雷菌2014-910√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√脑膜炎败血性黄杆菌2014-861√√√√√√√√√√√√√-√√√√√√弗氏柠檬酸杆菌2014-834√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√大肠埃希菌ATCC25922√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√铜绿假单胞菌ATCC27853√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√光滑念珠菌2014-CAP-F3-6√√√√√√√√√√√√√√√√√√-√葡萄牙假丝酵母2014-CAP-F3-7√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√都柏林/白色念珠菌2014-CAP-F3-8√√√√√√都柏林√√√√√都柏林√√√√都柏林√都柏林热带念珠菌2014-CAP-F3-9√√×√√√√√√√√√√√√√√√√√白色念珠菌ATCC14053√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√流感嗜血杆菌CMCC33533√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√第三十九页，共57页。卡片种类实验次数错误次数符合率GP1380100%GN2590100%YST99198.9%NH200100%第四十页，共57页。血清学检查第四十一页，共57页。血清学鉴定试验包括沙门菌/志贺菌/致病大肠杆菌/弧菌等的血清学分型。第四十二页，共57页。沙门菌至少包括伤寒沙门菌/甲型副伤寒沙门菌/乙型副伤寒沙门菌/丙型副伤寒沙门菌；志贺菌包括福氏志贺菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌四种；致病大肠杆菌/弧菌等根据当地卫生行政管理和实验室情况进行选择。霍乱弧菌每年由杭州市疾控中心进行检测验证。优先选择标准菌株和质控菌株，也可使用实验室确认过的留样临床分离株验证要求第四十三页，共57页。参照实验室相关SOP进行《XJ-SOP-409沙门菌属、志贺菌属检验》《XJ-SOP-410O1群、O139群霍乱弧菌检验》验证方案第四十四页，共57页。

要求准确率100%。可接受标准第四十五页，共57页。抗菌药物敏感性试验CNAS-GL41:4.7第四十六页，共57页。抗菌药物敏感性试验（药敏试验）可分为纸片法和最低抑菌浓度法（MIC法）。CNAS-GL41:4.7第四十七页，共57页。药敏试验方法的评估宜既保证药敏试验的准确性，也要确保耐药菌株的检出灵敏性。药敏卡的选择应遵循生产厂家说明书要求，不应超范围使用。药敏试验性能验证可使用药敏质控菌株。验证要求CNAS-GL41:4.7第四十八页，共57页。参考CLSI细菌、真菌相关药敏试验操作及判断标准，选择药敏质控标准菌株和药物。连续检测20－30天，每一组药物/细菌的抑菌圈直径或最低抑菌浓度（MIC）超出参考范围的频率应不超过（≤）1/20或3/30；也可采用替代质控方案，即连续5天，每天对每一组药物/细菌重复测定3次，每次单独制备接种物，15个数据中超出参考范围（抑菌圈直径或MIC）的结果应不超过（≤）1个，若失控结果为2-3个，则如前述，再进行5天，每天3次重复试验，30个数据失控结果应不超过（≤）3个。验证方案CNAS-GL41:4.7第四十九页，共57页。连续MIC法应计算基本符合率（EA，essentialagreement）：用于连续MIC法，AST设备得到的MIC结果与参考方法确定的MIC结果（或已知确认结果）相差在正负一个倍比稀释度内的符合率。性能指标EA=实验MIC在已知参考MIC的1个倍比稀释度内的试验数测试总数×100%第五十页，共57页。分类符合率（CA，categoryagreement）：用于非连续MIC法和纸片法，验证的药敏试验方法与参考方法或已确认结果间S/I/R判断的一致性。性能指标CA=药敏分类结果一致的试验数测试的总数×100%第五十一页，共57页。在新的药敏试验系统应用于临床前，须满足上述质控要求，通过后在日常检测中转为室内控制要求。应对较大和重大偏差进行分析，以确定特定细菌结果是否受影响并要求限制该细菌和特定抗菌药物在该设备的使用。可接受标准CNAS-GL41:4.7第五十二页，共57页。细菌名天数benzylpenicilinampicilingentamicinhigelevelstreptomycinhighlevelciproflxacinlevoflcacinmoxifloxacineythromycinclindamycinquinupristin/dalfopristinlinezolidteicoplaninvancomycintetracyclinetigecyclinenitrofurantoin粪肠球菌1SSSSSSSIRRSSSRSS2SSSSSSSIRRSSSRSS3SSSSSSSIRRSSSRSS4SSSSSSSIRRSSSRSS5SSSSSSSIRRSSSRSS6SSSSSSSIRRSSSRSS7SSSSSSSIRRSSSRSS8SSSSSSSIRRSSSRSS9SSSSSSSIRRSSSRSS10SSSSSSSIRRSSSRSS11SSSSSSSIRRSSSRSS12SSSSSSSIRRSSSRSS13SSSSSSSIRRSSSRSS14SSSSSSSIRRSSSRSS15SSSSSSSIRRSSSRSS16SSSSSSSIRRSSSRSS17SSSSSSSIRRSSSRSS18SSSSSSSIRRSSSRSS19SSSSSSSIRRSSSRSS20SSSSSSSIRRSSSRSS细菌名天数cefoxitinscreenbenzylpenicilinoxacilingentamicinciproflxacinlevoflcacinmoxifloxacininducibleclindamycinresistanceeythromycinclindamycinquinupristin/dalfopristinlinezolidteicoplaninvancomycintetracyclinetigecyclinenitrofurantoinrifampicintrimethoprim/sulfamethocazole金黄色葡萄球菌1-RSSSSS-SSSSSSSSSSS2-RSSSSS-SSSSSSSSSSS3-RSSSSS-SSSSSSSSSSS4-RSSSSS-SSSSSSSSSSS5-RSSSSS-SSSSSSSSSSS6-RSSSSS-SSSSSSSSSSS7-RSSSSS-SSSSSSSSSSS8-RSSSSS-SSSSSSSSSSS9-RSSSSS-SSSSSSSSSSS10-RSSSSS-SSSSSSSSSSS11-RSSSSS-SSSSSSSSSSS12-RSSSSS-SSSSSSSSSSS13-RSSSSS-SSSSSSSSSSS14-RSSSSS-SSSSSSSSSSS15-RSSSSS-SSSSSSSSSSS16-RSSSSS-SSSSSSSSSSS17-RSSSSS-SSSSSSSSSSS18-RSSSSS-SSSSSSSSSSS19-RSSSSS-SSSSSSSSSSS20-RSSSSS-SSSSSSSSSSS细菌名天数ampicilinampicilin/sulbactampiperacilin/tazobactamcefazolincefotetanceftazidimeceftriaxonecefepimeaztreonamimipenemmeropenemamikacingentamicintobramycinciproflocacinlevoflocacinnitrofurantointrimetho