克隆动物与转基因动物课件

克隆动物与转基因动物课件第1页，共59页，2023年，2月20日，星期三转基因动物第2页，共59页，2023年，2月20日，星期三Chapter1

概论第3页，共59页，2023年，2月20日，星期三Example.Geneconstruct

第4页，共59页，2023年，2月20日，星期三Example.microinjection第5页，共59页，2023年，2月20日，星期三Example.TransgeneanalysisBiopsyPCRanalysisSouthernblot第6页，共59页，2023年，2月20日，星期三Example.PhenotypicanalysisPhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice第7页，共59页，2023年，2月20日，星期三转基因动物的技术基础DNA重组技术胚胎操作技术动物个体第8页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.1concept----转基因动物外源DNA引起的遗传改变相关的遗传改变外源DNA片段至少整合到一条染色体的一个位点上；外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变；外源DNA的插入使染色体发生重排；导入可以持久存在的遗传实体，例如：一条人工染色体或者可以自我复制并传递给子细胞的非染色体DNA元件。第9页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.1concept----转基因动物外源DNA引起的遗传改变无关的遗传改变由于化学品的诱变作用导致基因发生改变；由于辐射作用导致基因发生改变；由于化学品或辐射的作用使染色体发生畸变；通过核移植交换遗传物质；使用基因治疗技术导入DNA等等。第10页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.1concept----转基因动物随机整合位置效应拷贝数定点整合Integrationof

foreigngene第11页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.1concept----转基因动物转基因动物的命名Founder(G0)G1,G2,…….人性化命名第12页，共59页，2023年，2月20日，星期三转基因动物微观性：具体技术宏观性：战略决策第13页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimalsVectorconstruct微观角度第14页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimalsTechniques微观角度Pronuclearmicroinjection(原核注射）ICSI(卵胞浆内单精子注射技术

)Cloning(nucleartransfer)SpermvectorRetrovirusvector第15页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimalsanalysisofPhenotypeProspectedtisssuesororgansRelatedtissuesororgansWholetissuesororgans微观角度第16页，共59页，2023年，2月20日，星期三目的基因表达载体转基因方法纯化技术临床实验宏观角度第17页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals转基因动物Fromthegenetothetransgenicanimal转：techniquesfortransgenesis“+”gene：transgenicanimals“-”gene：Knockoutmice“基因”:来源、构建、纯化宏观角度第18页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals转基因动物动物：选择物种(mouse,rat,livestock)动物的生殖生理、生殖内分泌、饲养管理转基因动物founder的分子鉴定转基因系的建立表型分析动物福利宏观角度第19页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.3History第一阶段：方法的建立Gurdonetal,Nature,1971,(蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA)---显微注射技术的尝试Jaenisch，PNAS,1974,1976，逆转录病毒感染小鼠的囊胚，使病毒DNA整合到小鼠的基因组中，并传递给后代---不能广泛应用，只是少数ES细胞整合外源基因，部分组织有外源基因

Gordonetal,PNAS,1980;Brinsteretal,Cell,1981;Costantini&Lacy,Nature,1981;Wagneretal,PNAS,1981---显微注射技术建立，基因结构没有合理和认真的设计，不能分析基因的生理功能第20页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.3History第二阶段：转基因小鼠模型及快速生长家畜Palmiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超级小鼠其它功能基因---基础研究中一直使用Hammeretal,1985,

Nature(rabbit,sheep,pig)GH为主，开始关注转基因动物的病理变化第21页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.3History第三阶段：乳腺反应器（目前正在开发的产品）异种器官移植Simmonsetal,1987,

NatureSheepbeta-lactoglobulininmousemilkGordonetal,1987,BiotechnolHumantPAinthemilkofmousePPL,1991humanAATinthemilkofsheep第22页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.3History第三阶段：异种器官移植(pig)

乳腺反应器TMtransgenemiceDenningetal2001,NatBiotech.(GT&PrP)Daietal,2002,NatBiotech(GT-outpig)Laietal,2002,Science(GT-outpig)第23页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.3History第四阶段：Knockout/Knockinmice(ES,NT)Livestock(克隆技术的入盟)1987，Thomas&Capecchi，Cell1987，Doetschmanetal,Nature

1989，Thompsonetal,Cell至2004年10月，约10%的mousegenome实现了Knockout第24页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimals1.3History第四阶段：Knockout/Knockinmice(ES,NT)

Livestock(克隆技术的入盟)Schniekeetal1997,McCreathetal2000,Science(F-IX)

Nature(AAT)第25页，共59页，2023年，2月20日，星期三基因治疗与治疗性克隆细菌发酵工程细胞工程克隆技术干细胞技术Transgenesis与相关技术第26页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimalsWhyproducetransgenicanimals人为地制造自然界不存在的突变分析异常表型变化推测原因加以利用1.2意义第27页，共59页，2023年，2月20日，星期三Part1.transgenicanimalsToobtainfundationalinformationonlivingorganismsandhumandiseases.解析哺乳类基因的功能(genefunction)研究生理系统的遗传调控(mechnisms)建立人类遗传疾病的模型(addedorinactivated)Touseanimalsasasourceofpharmaceuticalproteins,cellsandorgans（乳腺反应器）Toimproveanimalproduction（育种）1.7Applications第28页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.1.Examplesinbasicresearch1.7ApplicationsgeneadditionorreplacementProjectofknockoutmice第29页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7Applicationsgeneticdiseases：cysticfibrosis,CFTRgenemutation(needGM-rabbit,-sheep),

(mice不行,有chloridechannelcompensation)infectiousdiseases:一些病原体有种间特异性，因此需要将其受体导入动物中李斯特杆菌病：Lecuitetal,Science,2001Viralinfections:CD46-tgmice对麻疹V(Oldstone,etal,1999)uPA-tgmice与C型肝炎V(Fausto,2001)CD4-tgrabbit与HIV(Dunnetal,1995)CCR5-tg与HIV(Cohen,2001)第30页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7ApplicationsPriondiseasesPrPgeneandproteinarenessarybutnotsufficienttoinduceapriondiseaseinanimals(Moor&Melton,1997;Manloakouetal,2001;Denningetal,2000)Alzheimer’sdisease(属于综合性病变）不溶性beta-淀粉样蛋白和多体tau蛋白沉积引起的大脑病变，与prenisilin1&2genes,apolipoproteinB,IL-1等基因有关(Chapmanetal,2001)动脉粥样硬化(Atherosclerosis，属于综合性病变)多种与脂代谢有关的基因(Miller&Rubin,1997;Brousseau&Hoeg,1999)Celldeath(apoptosis)

该项技术已经确认了至少25个基因(Rangeretal,2001)第31页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7ApplicationsCanceractivationofoncogenesinactivationofanti-oncogenesMammarytumorsC-myc,erbB2,cyclinD1—Seigeletal,2000;Yuetal,2001Neu,ras,orWnt1----Akt----Schwertfegeretal,2001LungcancerK-ras:Johnsonetal,2001第32页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7Applications炎症性疾病----类风湿关节炎Brodmerkel&Vaddi,CurrOpinBiotech,2003第33页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7Applications炎症性疾病----肺炎Brodmerkel&Vaddi,CurrOpinBiotech,2003第34页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.3.ExamplesforXenografting1.7ApplicationsDaietal,2002,NatBiotech(GT-outpig)Laietal2002,Science.(GT–outpig)第35页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.3.ExamplesforXenografting1.7Applications(Inthescientificfield)RejectionmechanismsPossibleinfectionwithpigpathogens(virus,PrP)PigorgansmaynotfunctionefficiencyinhumansHeartKidney?LiverX第36页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.4.Examplesforanimalbreeding1.7Applications

两种策略(Houdebine,2002)

GeneadditionGenereplacementGeneselectionResistancetodiseases人畜共患病动物重点疾病(prion)，抗体，种间抗病基因lysozymeorLysostaphin(溶葡萄球菌素)genesDigestionandmetabolism脂肪酸代谢、降低饲料成本、减少猪粪污染(唾液腺表达细菌植酸酶phytase基因，Golovanetal,2001a,b)往反刍动物瘤胃中转移将乙酸转化成葡萄糖的基因第37页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.4.Examplesforanimalbreeding1.7ApplicationsMilkcomposition（人类30%的蛋白来源）K-casein↑→减少微球粒尺寸，稳定奶(Brophyetal,2003cow)s1-casein↑→有利于提高整个奶中蛋白含量toKnockoutbeta-lactoglobulingene,majormilkallergen必需脂肪酸、减少乳糖（20%ofhuman不消化乳糖，不能喝奶）Jostetal,1999奶制品工业需求（cheese,yoghurt,etc)、人源化奶、口服疫苗(抗冠状病毒的抗体)适合动物后代的奶成分(pigexpresscow-lactalbumin-仔猪成活↑

Carcassandwoolgrowth生长速度，GHinpig,60头中筛选了5个品系（Nottle，1997）生长速度:myostatingene(Yangetal,2001)增加不饱和脂肪酸（fad2,fat-1）:Kangetal,2004羊毛细度:enhancingcysteinesynthesis第38页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.4.Examplesforanimalbreeding1.7ApplicationsFADtransgene18:3微生物、部分海洋生物高等植物人、哺乳类16:018:018:118:222FAD3酶Ω-6脂肪酸Ω-3脂肪酸饱和脂肪酸单不饱和metabolismpathwayoffattyacidsFAD2酶FAD样酶抗癌物CLA第39页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.5.Examplesinpharmaceuticalproduction1.7Applicationstraditionalpharmacopoeia

crudeplantextractsChemicalsynthesisproteinpharmaceuticals

extractedproteinsfromhumanoranimalorgans(advantage:nativestateandquiteactive，drawbacks:产量低，contamination(virus,prions)Insulin---pigpancreasGrowthHormoneCoagulationfactorsAntibodiesBSA第40页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.5.Examplesinpharmaceuticalproduction1.7ApplicationsRecombinationproteins—GeneticengineeringGeneticallymodifiedbacteriaoryeast

(优点：纯度较高，活性接近自然；缺点：部分蛋白不能合成、纯化困难、不能糖基化、不能翻译后加工等)Humaninsulin,humanGHGeneticallymodifiedanimalcells(优点：质量好，自然活性；缺点：产量低，≤10kg/年)Hybridomas(mAb，产量高);CHO(HumanFSH;EPO)GManimalsBloodmilk

(优点：质量好，产量高；缺点：技术难度大，风险高)第41页，共59页，2023年，2月20日，星期三重组药物实例：r-huFSHglycoprotein(Gonal-F)r-hFSH(GONAL-F):Ares-Serono,Switzerland(rFSH;Puregon):Organon,TheNetherlandsPituitarycDNAlibrariesDihydrofolatereductase第42页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.7.6.glandbioreactor1.7Applications生物反应器：乳腺血液尿液生物反应器：乳腺血液尿液第43页，共59页，2023年，2月20日，星期三动物乳腺生物反应器

乳腺生物反应器的研制，就是通过基因转移技术，将外源基因导入动物体内，通过乳腺特异启动子的控制，获得乳腺生产外源蛋白质的转基因动物。

Gordonetal,1987,NatureBiotechnology,humantPA/mousemilk第44页，共59页，2023年，2月20日，星期三动物乳腺反应器产生的背景转基因技术的成功商业要求：1g/L第45页，共59页，2023年，2月20日，星期三乳腺产品的优越性产物多样：多肽（）到大分子蛋白（）分泌性蛋白到内膜蛋白多聚体（二价抗体、三价fibrinogen）质量好（糖基化、磷酸化、天然折叠等）安全，不会引起抗药性产量高纯化简单成本低第46页，共59页，2023年，2月20日，星期三动物乳腺生物反应器产品的开发和利用

动物种类的选择转基因技术的选择基因表达载体的选择目标产品的选择第47页，共59页，2023年，2月20日，星期三动物乳腺生物反应器产品的开发和利用

专利的影响第48页，共59页，2023年，2月20日，星期三动物种类的选择第49页，共59页，2023年，2月20日，星期三2、动物乳腺特异性表达载体第50页，共59页，2023年，2月20日，星期三目标产品的选择

血液蛋白质第二代医用蛋白质基因工程牛奶其它工业蛋白质兽医产品第51页，共59页，2023年，2月20日，星期三血液蛋白质第52页，共59页，2023年，2月20日，星期三第53页，共59页，2023年，2月20日，星期三Companiesproducingbioproductsusingtransgenicdomesticlivestock(2004)第54页，共59页，2023年，2月20日，星期三用动物乳腺生产第二代产品举例第55页，共59页，2023年，2月20日，星期三乳腺产品的缺点