动物细胞融合与单克隆抗体技术

动物细胞融合与单克隆抗体技术第1页，共53页，2023年，2月20日，星期四5.1细胞融合与杂交第2页，共53页，2023年，2月20日，星期四一、概念细胞融合：两个或两个以上相同的细胞合并形成一个细胞的过程。细胞杂交：两个或两个以上不同的细胞合并形成一个细胞的过程，包括种内杂交和种间杂交。第3页，共53页，2023年，2月20日，星期四二、原理

异核体阶段杂种细胞形成同核体异核体合核体关键是膜的融合：两个亲本细胞并列，细胞膜接触膜组织局部破坏形成包围融合细胞的连续胞膜第4页，共53页，2023年，2月20日，星期四细胞融合过程可分为：凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提脂质分子重排：是实现细胞融合的关键胞质合并：后续的稳定步骤。第5页，共53页，2023年，2月20日，星期四1.病毒介导融合：（1）诱导原理三、细胞融合方法（2）操作步骤(3)病毒诱导融合的特点第6页，共53页，2023年，2月20日，星期四2.化学融合剂诱导融合（P107）（1）化学融合剂的种类三、细胞融合方法（2）PEG诱导的原理

（3）PEG诱导的特点sp3杂化，有孤对电子，可与H2O形成H键而具有强烈的吸水性。第7页，共53页，2023年，2月20日，星期四3.电融合技术

三、细胞融合方法第8页，共53页，2023年，2月20日，星期四电融合的特点

①融合频率高，对细胞伤害小②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞③非特异性融合三、细胞融合方法磁-电融合声-电融合电-机械融合细胞化学聚集融合生物素-抗生物素-抗原-抗体桥联第9页，共53页，2023年，2月20日，星期四4.激光诱导细胞融合（1）原理：光镊所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接触式捕获。（2）特点：可对单个核细胞进行操作，但设备昂贵，操作技术要求高。三、细胞融合方法第10页，共53页，2023年，2月20日，星期四5.微流控芯片的细胞融合技术（1）原理：将微通道网络整合到生物芯片上，使得微流控系统成为细胞融合的理想平台（2）特点：实现大量单个成对细胞的融合（二）细胞融合的方法第11页，共53页，2023年，2月20日，星期四6.细胞融合的影响因素细胞的种类和性质细胞表面性质细胞种类亲本细胞的亲缘关系融合温度及PH等环境条件离子强度及离子种类三、细胞融合方法第12页，共53页，2023年，2月20日，星期四四、融合子检出的选择系统遗传互补选择营养缺陷型互补选择抗性互补选择形态特征互补选择生长特性选择第13页，共53页，2023年，2月20日，星期四遗传互补选择-HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)

谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸四氢叶酸AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-短期存活，最终死亡死亡外源性途径(旁路途径)杂交瘤细胞：HGPRT+，TK+长期存活第14页，共53页，2023年，2月20日，星期四五、融合子的鉴定方法细胞学鉴定：染色体数目，形态结构生化分析：同工酶谱为双亲的总和分子生物学鉴定：DNA探针第15页，共53页，2023年，2月20日，星期四六、细胞融合技术的应用基因定位和人类基因图谱绘制肿瘤免疫的研究：肿瘤树突状细胞疫苗单克隆抗体的生产动物新品种的培育第16页，共53页，2023年，2月20日，星期四5.2杂交瘤技术一、B淋巴细胞杂交瘤技术原理：细胞融合+克隆选择理论

第17页，共53页，2023年，2月20日，星期四EmilvonBehring,1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinners第18页，共53页，2023年，2月20日，星期四免疫球蛋白的单体分子结构

第19页，共53页，2023年，2月20日，星期四第20页，共53页，2023年，2月20日，星期四第21页，共53页，2023年，2月20日，星期四第22页，共53页，2023年，2月20日，星期四第23页，共53页，2023年，2月20日，星期四第24页，共53页，2023年，2月20日，星期四第25页，共53页，2023年，2月20日，星期四第26页，共53页，2023年，2月20日，星期四1.亲本细胞的制备（1）骨髓瘤细胞特性

①不能分泌抗体②HGPRT－或TK－缺陷型③长命细胞二、B淋巴细胞杂交瘤技术的操作流程（2）B淋巴细胞特性：①分泌抗体②短命细胞第27页，共53页，2023年，2月20日，星期四动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体第28页，共53页，2023年，2月20日，星期四2.饲养细胞的制备及作用饲养细胞的作用：提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。饲养细胞的制备：腹腔巨噬细胞第29页，共53页，2023年，2月20日，星期四3.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖第30页，共53页，2023年，2月20日，星期四4.HAT选择性培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater第31页，共53页，2023年，2月20日，星期四杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活第32页，共53页，2023年，2月20日，星期四5.阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）常用方法：要求：

简便、快速、敏感;

在短时间内能检测大量样品酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法第33页，共53页，2023年，2月20日，星期四酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：第34页，共53页，2023年，2月20日，星期四6.杂交瘤细胞的克隆培养常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微操作法1个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。第35页，共53页，2023年，2月20日，星期四7.杂交瘤细胞的冻存与复苏目的：保种方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中第36页，共53页，2023年，2月20日，星期四8.单克隆抗体的规模化生产

主要有两种方法（1）体外法：用人工反应器大量培养杂交瘤细胞（2）体内法：用生物体作为细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞第37页，共53页，2023年，2月20日，星期四转瓶培养第38页，共53页，2023年，2月20日，星期四微载体培养第39页，共53页，2023年，2月20日，星期四9.融合后杂交瘤不生长的原因分析：聚乙二醇有毒小牛血清的质量有问题；支原体污染HAT有问题第40页，共53页，2023年，2月20日，星期四10.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体原因分析

融合后经HAT选择有细胞克隆出现，但不能筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是：抗体检测法不够敏感HAT选择失败动物免疫不成功染色体丢失和克隆竞争第41页，共53页，2023年，2月20日，星期四三、T淋巴细胞杂交瘤概念：T淋巴细胞亚群经有丝分裂原刺激后能分泌多种淋巴因子。将之与胸腺瘤或淋巴瘤BW5147株融合而建立的T淋巴细胞杂交瘤株。淋巴因子：干扰素、白细胞介素2、巨噬细胞激活因子等第42页，共53页，2023年，2月20日，星期四四、抗体的发展现状人鼠型杂交瘤：人淋巴细胞+鼠骨髓瘤细胞问题：易丢失人染色体人型杂交瘤：人淋巴细胞+人骨髓瘤细胞问题：①尚未获得理想的瘤系，②建株困难，抗体产量太低等1.人源单克隆抗体第43页，共53页，2023年，2月20日，星期四2.鼠源单克隆抗体鼠衍生杂交瘤：问题：①出现人抗鼠抗体反应②鼠抗体不能有效激活人免疫系统第44页，共53页，2023年，2月20日，星期四(1)抗体DNA重组

通过基因工程技术用人蛋白取代鼠抗体的恒定区，仍保留鼠蛋白在抗体中的可变区，形成约含有65%人蛋白的嵌合抗体。

问题：含有一定量的鼠蛋白，亲和力差，产量低，纯化费用高，临床效果差3.基因工程抗体第45页，共53页，2023年，2月20日，星期四人－鼠嵌合抗体第46页，共53页，2023年，2月20日，星期四第47页，共53页，2023年，2月20日，星期四(2)噬菌体表达技术

用体外基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，插入噬菌体表达载体，转化工程细菌进行表达。问题：①没有经过天然抗体成熟，亲和力低②需要相当复杂的抗体基因技术和多轮筛选才能获得。3.基因工程抗体第48页，共53页，2023年，2月20日，星期四(3)外因鼠技术

将小鼠体内产生抗体的基因灭活，然后将人的抗体基因转入小鼠早期胚胎，获得含有人抗体的小鼠—外因鼠。前景：①100%全人源化单克隆抗体

②2011年全球有7种治疗性全人单克隆抗体获得美国FDA和欧盟的批准，这些全人抗体几乎完全由转基因小鼠产生。3.基因工程抗体第49页，共53页，2023年，2月20日，星期四五、单克隆抗体的应用