紫外可见04课件

卫生检验基础营养与保健医学系

第三章紫外可见分光光度法紫外－可见分光光度法(Ultravioletvisiblespectrophotometry)是有机化合物结构鉴定的四大光谱(质谱、核磁、红外、紫外－可见)之一，也是仪器分析常用的一种快速、简便的分析方法。它是根据物质的分子对紫外、可见光区辐射的吸收特征对物质结构和组成进行定性或定量的方法。

紫外可见分光光度法近年来，紫外－可见分光光度法由于采用了先进的光电二极管阵列及计算机技术，使仪器的性能得到极大提高，加上各种应用方法的不断创新与改善，使之达到了前所未有的水平，成为常规质量控制和质量分析不可缺少的方法之一，在工农业、医药卫生、环境保护、生命科学等各领域广泛应用。第一节基本原理

物质分子吸收一定光能后，外层电子会从基态跃迁到激发态，发生能级跃迁，产生吸收光谱。分子吸收能量具有量子化特征，它只吸收等于两个能级之差的能量，即E＝E2－E1＝hv。分子光谱比原子光谱复杂得多，因为分子中除外层价电子吸收辐射能量能产生跃迁外，而且还有组成分子的原子在吸收能量后引起的振动和整个分子的转动运动，因此分子吸收的总能量是三种运动能量之和。E＝E电＋E振＋E转

第一节基本原理

三种不同运动涉及三种跃迁能级，它们之间能量差别依次是E电>E振>E转，所以当物质吸收能量发生电子能级跃迁时，不可避免地会伴随着产生振动能级和转动能级的跃迁，从而导致了分子吸收光谱谱带变宽。价电子跃迁能级的能量差在1～20ev，相应的光辐射波长为200～760nm，属紫外可见区，其光谱就称为紫外可见吸收光谱。

二.紫外－可见吸收光谱

与分子结构的关系

1.有机化合物的吸收光谱紫外－可见吸收光谱由分子的价电子跃迁决定。分子组成不同，产生的吸收光谱也不同。分子吸收能量后，外层价电子将从成键轨道跃迁至能量较高的反键轨道中，在紫外、可见区域常见的跃迁包括，n,n,四种，各种电子由基态跃迁到激发态时所需能量不同，它们所需的能量依次如下：

>n

>nn和跃迁是用紫外、可见分光光度法研究有机物的最常见的跃迁类型。这类跃迁易发生，所需能量使吸收波长都处在200nm以上区域，所涉及的基团都具有不饱和的键，这种含不饱和键的基团称为生色团。(1)共轭双键的数目具有共轭双键体系、结构相似的一系列有机化合物,随着共轭双键的增加,化合物的最大吸收显著红移,吸收强度增大,颜色加深。对芳香化合物,随着共轭体系的增大,最大吸收显著红移,颜色加深。(2)助色团

共轭体系的有机化合物分子中,引入吸电子或给电子助色团,最大吸收向长波方向移动,颜色加深;在共轭体系的两端或苯环的对位同时引入两种不同性质的助色团,其助色作用更为显著。(3)分子离子化

含有吸电子或给电子助色团的有机化合物分子具有离子化的特性,这种离子化作用导致吸电子基的吸电子能力或给电子基的推电子能力加强,共轭体系的电子云发生偏移极化,跃迁的能级差缩小,最大吸收峰红移,颜色加深。(5)空间位阻效应

共轭分子中,各原子都处在同一平面内,能产生最好的共轭作用,当共轭分子的平面结构因空间位阻或其它因素的影响而受到破坏时,共轭体系被分割,电子云重叠程度减弱,在共轭体系中电子的流动性受到某种程度的阻碍,最大吸收向短波方向移动,颜色变浅。2.金属配合物的

电子吸收光谱

金属离子与配位体反应,从生色机理上看,可分成三种类型:(1)配位体微扰的金属离子d－d电子跃迁和f－f电子跃迁(2)电荷转移跃迁光谱(3)金属离子微扰的配位体内电子跃迁。对某一金属配合物来说，可能来自其中的一种或几种同时起作用。对一自由态过渡金属离子，在没有电磁场作用下，离子处于五重简并的基态。在水溶液中，当有水分子或其它配位体与金属离子形成配合物时，d轨道与配位体偶极子作用，破坏了d轨道的简并性，使d轨道分裂为2个或多个能级组，吸收紫外－可见光能量时，就可能在分裂之后的能级见发生电子跃迁，形成d－d电子跃迁光谱。电荷转移吸收光谱在许多无机化合物、有机化合物和过渡金属配合物中都可见到，在分光光度法中有重要意义。当分子吸收辐射后，分子中的电子从主要定域在金属M的轨道转移到配位体L的轨道或按相反方向转移，产生的吸收光谱叫电荷转移吸收光谱。这种光谱通常发生在具有d电子过渡金属和有键共轭体系的有机分子中，故又称d－生色团。电荷转移光谱主要有三种类型：配位体金属的电荷转移，金属配位体的电荷转移以及金属金属间的电荷转移光谱。

金属离子与有色的有机配位体反应生成配合物所引起的颜色变化，主要决定于金属离子与配位体之间成键的性质。当金属离子与配位体分子结合本质上是静电的，则金属离子类似于配位体质子化的方式影响其光谱，这种影响通常表现为配合物的吸收光谱稍向红移或紫移，但吸收光谱的形状和摩尔吸收光系数变化不显著。三.光的选择性吸收和

朗伯－比尔定律

物质对光的吸收具有选择性，物质只能吸收其特定波长的光，有色物质都是由于吸收了可见光中的部分光，显示的颜色是吸收光的补色；物质对紫外光的吸收也有选择性，化合物的分子结构不同，对光的吸收也不同，这即是紫外－可见分光光度法的定性原理。

四.影响准确度的因素

1.反射和散射效应的影响2.化学反应引起的误差3.待测组分浓度的影响4.溶剂及试剂中杂质的影响5.狭缝宽度6.吸收池引起的误差1.反射和散射效应的影响

光束在空气－吸收池和吸收池－溶液界面上的反射一般不致引起比尔定律的偏离，但如果样品溶液和参比溶液或者不同的样品溶液的折射率不同而引起反射损失不同，就会产生误差。物质的吸收定律只适用于均匀介质的吸收体系，如果待测溶液有混浊质点，当辐射通过时，将产生散射效应，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致偏离吸收定律。然而，混浊试样在生化、临床和环境科学领域中极为常见，为了减小或消除由此引起的误差，可采用双波长或三波长分光光度法。2.化学反应引起的误差

分光光度法涉及的酸碱反应、络合反应、缔合反应、溶剂化反应及各种有机反应，当反应达到平衡时，如被测组分的表观浓度与其真实浓度存在一定的差别，会导致偏离比尔定律。4.溶剂及试剂中杂质的影响

有些溶剂，分子与待测物分子间由于形成氢键或溶剂化合物，使吸收带变宽，对比尔定律产生偏离，溶剂中的杂质有时在测定波长也会产生吸收，因此，测定时应尽量使用高纯度溶剂。5.狭缝宽度

狭缝宽度影响光谱的纯度，也影响吸光度值，为了得到精细的光谱结构，必须用最小的狭缝，但小的狭缝宽度，使辐射能明显减小，给微弱吸收带的测量造成困难，因此，在定量分析时为了得到足够的测量信号，应采用较大狭缝；在定性分析时采用较小的狭缝。当出射狭缝和入射狭缝的宽度相等时，狭缝宽度引起的误差最小。

单色器即色散装置，是使不同波长的光以不同角度发散的组件。仪器中常用的两种色散元件是棱境和全息光栅。吸收池即样品池，由玻璃或石英制成，玻璃吸收池只能用于可见光区，而石英吸收池既可用于可见光区也可用于紫外光区。检测器将光信号转换为电信号，理想的检测器应有宽的线性响应范围，噪声低，灵敏度高。分光光度计的检测器一般为光电倍增管或光电二极管。目前采用的二极管阵列检测技术是紫外－可见分光光度计的一个革新，一台普通的二极管阵列光度计相当于上百台普通的分光光度计，它采用“倒光学”系统设计，使得每一时刻获得的是波长范围内每一波长的吸收值，每一时刻都可获得一全波长的测定光谱。二.分光光度计类型

商品化的分光光度计有不同的构型，按光路系统可分为单光束、双光束和分光束分光光度计；按测量方法可分为单波长和双波长分光光度计。传统的分光光度计和二极管阵列分光光度计都是单光束的。单光束仪器成本较低，而且简单的光路可提供高的光通量，因此灵敏度高。国家标准研究机构，如美国的国家标准和技术研究所及英国的国家物理实验室使用的标准分光光度计都是单光束分光光度计。

二.分光光度计类型

双光束分光光度计的设计是用于消除测量空白和样品池之间由光源强度变化引起的误差。这种设计中，在接近光源的光路处放一斩光器，依次将光线从参比光路和样品光路送入检测器，斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次，因此能校正光源强度中的漂移。分光束分光光度计类似于双光束分光光度计，但它使用一个分裂器代替斩光器将光分成两束同时穿过参比和空白的光路，再到达两个分开但一样的检测器。这个结构可同时测定样品和空白，在机械设计方面比真正的双光束简单，但由于它使用两个独立的检测器，会引起另一种潜在的漂移。

二.分光光度计类型

双波长分光光度计的单色器含有两个色散装置(实际上是双色器)，输出两束单色光，通过斩光器使不同波长的两束光交替地照射到同一盛有样品液的吸收池，记录两个波长的吸光度差。它的优点是能够消除背景吸收和干扰吸收。这种复杂的仪器一般比传统的分光光度计贵得多，现大部分已被多波长二极管阵列分光光度计代替。三.仪器性能检定

1.波长准确度和波长重复性仪器性能是否处于正常工作状态将直接影响到测定结果的准确性和可靠性,因此仪器在使用前对某些仪器参数进行检定是很有必要的。主要检定过程如下:

(1)氘灯检定用仪器固有的氘灯,取单光束能量方式,采用波长扫描,扫描速度慢(如15nm/min),响应快,最小带宽(如0.1nm),量程取0%~100%或参照仪器说明书设定条件,在波长486.02nm及656.10nm两个单峰重复扫描三次,测量谱图上的两条谱线波长,与表1比较,同时计算及。

表1氘灯的反射波长(nm)编号12波长486.02656.10

＝－

＝max－min

――波长的准确度――波长的重复性

――波长测量的平均值――波长标准值

max、min――三次测量波长的最大值与最小值

波长的准确度和重复性概念经常被混淆。比较不同仪器之间的测量结果时，波长的准确度十分重要；而同一台仪器测量时，波长的重复性是最重要的。准确的定量分析所选择的分析波长应是最大吸收波长，而二极管阵列分光光度计是波长设置重复性极佳的仪器。(2)氧化钬玻璃检定

测量条件同上,量程0~2A。将氧化钬玻璃置于样品室内，以空气作参比，在波长220nm~660nm范围扫描，取谱图上二条谱线的波长与表2比较，并计算和，计算方法同氘灯检定。2.透过率准确度与透过率重复性

(1)紫外区仪器带宽取2nm,用标准石英吸收池分别盛装空白溶液及重铬酸钾标准溶液(标准溶液配制方法见参考文献4),在235nm、257nm、313nm和350nm四个波长处连续三次测量其透过率，计算透过率准确度r。

(2)可见光区仪器带宽取2nm,用一组透过率为10％、20％、30％的光谱中性滤光片，以空气为参比，分别在波长440nm、546nm和635nm处连续三次测量透过率，与中性滤光片的透过率标准值比较，同样计算r和r。

r＝T－Tr

r＝Tmax－TminT――透过率平均值Tr――透过率标准值Tmax、Tmin――三次测量透过率的最大值和最小值此外,根据实际需要,也可对光谱分辨率或光谱带宽、噪声、漂移等参数进行检定。第三节定量分析

紫外－可见分光光度法主要用于定量分析。一.单组分定量方法

常用的方法有标准曲线法和标准对照法。根据Larbert－Beer定律，配制一系列已知浓度的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液为参比，在相同条件下测定标准溶液的吸光度，绘制吸光度－浓度曲线，即得标准曲线；在相同条件下测出未知样品的吸光度值，从曲线上找出与之对应的浓度就可知未知样品的浓度了。标准对照法是在相同的条件下测出标准品和未知样品的吸光度值，根据As＝kCs,Ax＝kCx可得Cx＝CsAx/As二.多组分分析

按照Larbert－Beer定律，物质的吸光度与吸收特定波长下照射光的分子数成正比，也就是一种混合物在任何波长下的吸光度等于混合物中各组分在该波长下的吸光度之和。1.联立方程法简便的多组分分析方法是选择和混合物中待测物质数目相同的不同波长测定吸光度，选定的波长通常是每个组分最大吸收值的波长，各波长下混合物的最大吸光度值为该波长下各组分吸光值之和。A1(x+y)＝A1x+A1y=1xbCx+1ybCyA2(x+y)＝A2x+A2y=2xbCx+2ybCy解出上面的联立方程，就可得到各组分物质的浓度。式中A1和A2分别是组在波长1和2时的吸光度，1和2是组分在波长1和2时的摩尔吸光系数。2.最小二乘法随机噪声的影响可通过附加的光谱信息来降低，即采用多点定量而不只是两点的数据，在遵守Beer定律和光吸收加和原理时，设吸收池的厚度为1cm，则A＝1C1＋2C2A/1=C1+C22/1或A/2=C11/2+C2A为混合物总吸光度,1和2为组分1和组分2的摩尔吸光系数。将式作y＝a+bx的一元回归处理，即可分别求得C1和C2。用联立方程法和最小二乘法得到准确分析结果的必要条件是：要用纯标样或样品中有紫外光谱吸收的每个组分的混合标样进行校正，未知样品不允许有额外的光吸收。其他多组分分析的统计方法有偏最小二乘法、关键组分回归法、多重最小二乘法，理论上，这些方法较前面提到的方法各有优点，而实际上校正过程是相当复杂的。第四节光谱干扰及校正方法一.干扰类型1.其它物质吸收干扰在理想情况下，使用紫外－可见分光光度法测量时，应该只有待测物才会产生吸收，而实际上由于物理和化学的原因，常会产生很多干扰测量的吸收。若在待测物吸收光谱区域内存在其它吸收物质，则会产生吸光度测量的误差。某些情况下，只存在一种已知干扰物，如合成药剂时的副产物；另一些情况，会有很多种吸收干扰物，而且大多数是未知干扰物，如血液等生物样品，可以产生很多强的基体吸收。2.散射

在药物和生物样品分析中，常会出现由于溶液中存在悬浮颗粒，发生散射的问题。光散射会产生背景吸收，干扰吸光度测量。散射时，入射光照射到溶液中却改变了方向,因此，即使没有吸收，到达检测器的光也会减弱。在紫外－可见光谱区，可观察到两种类型的散射：一种是瑞利(Reyleigh)散射，出现在散射粒子小于光线波长的情况下，散射强度与波长四次方成反比;另一种是丁达尔(Tyndall)散射，出现在散射粒子大于光线波长的情况下，强度与波长平方成反比。散射造成的误差随波长减小而增加。

二.干扰校正方法

消除或减小干扰误差的校正方法很多，一般来说，如果误差来源已知，且不随样品而变，就能消除该误差；另一方面，如果误差来源未知，且随样品变化，误差能降低但不能完全消除。校正技术通常至少要在两个波长处采集数据，更高级的校正技术需要多波长或全光谱数据。1.双波长分光光度法双波长分光光度法也称等吸收度消去法。当干扰物已知，吸收光谱也已知时，该干扰物在测定波长下对待测物产生的误差可通过选择参比波长加以消除。测定时选择一个测定波长2，一个参比波长1，选择原则是在这两个波长下使干扰组分的吸收相等，则样品的总吸光度是：A1＝A1样＋A1干A2＝A2样＋A2干

A＝A2－A1＝（A2样－A1样）＋〔A2干－A1干〕因A2干＝A1干

A＝2bC样－1bC样＝（2－1）bC样＝kC样由此测得的混合物的吸光度差值A只与待测组分的浓度成线性关系，而与干扰组分无关。关于等吸收点波长的选择，常用的方法有作图法，一波长固定、另一波长扫描法和系数倍率法等。(1)作图法

I为待测组分，II为干扰组分，将I的最大吸收波长2作为测定波长，从2向下作横轴的垂线与II的吸收光谱交于M点，从M点作横轴的平行线交于II的另一点N，N点对应的波长即为1，如图－1所示。如果等吸收点不止一个，则选择A应足够大，且1和2波长差较小的两个波长作为组合波长，以提高测量的精密度。(2)一波长固定、另一波长扫描法

配数种不同浓度的干扰组分溶液，以待测组分的最大吸收波长为固定波长，对不同浓度的干扰组分溶液进行扫描，得到一组吸收光谱群，从吸收光谱群和基线可以找到1和2，如图－2所示。此法组合得到的2和1能克服作图法选择等吸收点因干扰组分浓度变化而影响吸收光谱形状的特点，测得的A值不受干扰组分浓度变化的影响。(3)系数倍率法

亦称K系数法。此法适用于干扰组分的吸收光谱无吸收峰的测定。它是在双波长分光光度计的电学回路中，引入系数倍率器，使1和2处的吸光度信号分别按选择的系数放大。如用双波长分光光度法测得的吸光度差为

A＝K2A2－K1A1当A2<A1时,设K1＝1,则

A＝K2A2－A1调节系数倍率器,使K2A2＝A1，则A＝0当待测组分与干扰组分吸收峰重叠时，设待测组分在两波长处的吸光度分别为A1’和A2’，干扰组分在两波长处的吸光度分别为A1和A2，两组分的混合物在两波长处的吸光度为A1’’和A2’’，调节系数倍率器，使在2处的吸光度增大K2倍，则

A＝K2A2’’－A1’’＝K2(A2＋A2’)－(A1+A1’)=(K2A2－A1)+(K2A2’－A1’)K2A2=A1

A=K2A2’－A1’上式说明，由于调节系数倍率器，可消除没有吸收峰干扰组分的影响，A只与待测组分的吸光度有关，与待测组分的浓度成正比。2.背景模型法

背景模型法适合于由物理因素（最常见的是散射）引起的干扰。该方法的原理是分析波长下的干扰情况可由其它波长下的模型外推来估计。选择一段只有干扰物吸收的光谱，用最小二乘法拟合吸光度的对数，以此来建立一个多项式来拟合这段光谱。A＝anlgA＝lga+nlgA为吸光度，为波长，n为吸光度和波长关系的幂，a为常数，通过拟合得到的系数，可以估算出所有其它波长背景处的吸收，再将测量值减去估计值即可得到待测物的吸光度值。3.内参比法

用一个参比波长的内参比法是最简单的校正技术之一。该法常在两次测量时有基线漂移时使用。一般来说，选定的参比波长最好时尽量接近测量波长，但待测物没有明显吸收。将分析波长处的吸光度值减去参比波长处的吸光度值，就可消除光谱干扰，只要干扰在全波长范围内是一常数。虽然，实际上干扰在全波长范围内并不总为常数，但这种简单的技术却常能出人意料地提高准确度。4.三点校正法

亦称Morton－Stubbs校正，如图－3所示。该法采用两个参比波长，参比波长分别选在分析波长两边，然后用线性内推法估计出分析波长处的背景干扰吸收。这种方法比单波长参比技术更好，因为任何与波长呈线性关系的背景吸收都可得到校正；在很多情况下，若波长范围很窄，该法同样适用来自散射或复杂基体非线性背景吸收的校正。5.导数光谱法

导数光谱法可用于减小或消除很多来源的背景干扰。通过一阶求导，恒定的基线补偿可以消除；二阶求导，随波长呈线性增加的背景吸收又会被消除，依次类推。第五节导数光谱法一.基本原理导数光谱法又称微分光谱法。以吸光度A对波长的吸收曲线称为零阶光谱；在零阶光谱中，以吸光度的变化dA对波长的变化d的变化率对波长作图，便可得到一阶导数；以d2A/d2对的图谱，就是二阶导数光谱。依次类推，可得到更高阶数的导数光谱。导数光谱特征导数光谱具有以下特征：1.零阶光谱上的极大在奇数阶导数光谱中为零;在偶数阶导数中为极值。因此极小和极大交替出现。2.光谱的极值数随导数阶数的增加而增加，表现为第n阶产生n＋1个极值。这是因为吸收曲线上的拐点在奇数导数中产生极值，在偶数导数中过零点，这些在吸收曲线上原来并不存在的极值是由拐点求导形成的。3.随着导数阶数的增加，吸收峰的尖锐程度增大，使谱带变窄，从而提高了光谱的分辨率。二.干扰消除机理导数光谱的最大优点是能消除共存组分无关吸收的干扰。一阶导数光谱可消除对波长呈一次函数的干扰组分的无关吸收，原理如下：当待测组分与对波长呈一次函数的干扰组分共存时，则：A＝A待＋A干＝bC＋t＋udA/d＝(d/d)bC＋u这样，一次函数的无关吸收（A干＝t＋u）的一阶导数值成了与浓度无关的常数u，其在一阶光谱中只影响待测组分一阶曲线的纵向位移，而不影响作为定量参数的振幅值。三.定性分析

导数光谱图谱比较复杂，峰的数目随导数阶数的提高而增加，在定性分析时，这种复杂性十分有用，既表明了物质的特性，又有助于鉴定。导数光谱可用于放大图谱间的差别，定性分析中可分辨重叠谱。下图是一计算机模拟图，图中显示的是两个相隔30nm的高斯峰，用光吸收测量时叠加在一起，形成一个极大值位于两个单独峰极大值中间的一个宽带，两个峰没有分开；在四阶导数光谱时，这两个峰十分明显，其最大值接近单独存在时的两个最大吸收波长的位置四.定量方法

导数光谱法可以减少定量分析中来自散射、基体及其它吸收物的干扰影响，吸收光谱服从Beer定律，为讨论方便，令b＝1cm，则A＝C对求导，有dA/d＝(d/d)Cd2A/d2＝(d2/d2)C上式表明，导数信号与浓度成正比，这是导数光谱法的定量依据。信号对浓度的灵敏度取决于吸光系数在特定波长下的变化率。通过对导数信号的测量，可以对待测组分的含量准确定量。1.基线法又称正切法画一条直线正切于两个相邻的极大或极小，测量中间的反向峰峰尖至切线的距离b，b值与待测组分标准溶液的浓度成正比，可得一条标准曲线。此法能较好的适用于非线性吸收干扰试样的测定。2.峰－零法在基线平直条件下，通过测量峰至基线间的距离来确定待测组分的含量，极值至零值间的垂直距离正比于浓度C。