伪狂犬病毒PCR诊断

伪狂犬病毒PCR诊断实验目的：1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；2、掌握伪狂犬病毒PCR检测的方法；实验内容：1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤，让同学们观看PCR反应的动画；2、伪狂犬病毒PCR检测。2020/11/42什么是PCR？

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。一、PCR反应的原理、方法及操作步骤2020/11/43PCR及有关技术的发展历史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。1985关于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上发表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)2020/11/44PCR及有关技术的发展历史（2）1987当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus仪器公司（PECI）于这一年的11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪。1989Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。2020/11/45PCR及有关技术的发展历史（3）1992年3月Cetus公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利；

KaryMullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。2020/11/46PCR及有关技术的发展历史（4）九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测1999年西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查2020/11/47PCR原理PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。2020/11/48PCR原理PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增。2020/11/49（1）DNA模板的热变性

将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。（2）模板与引物的结合（退火或复性）

将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。2020/11/410（3）引物延伸

将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸，形成两条与模板互补的新链。

以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸）

（新合成的链可作为下一轮循环的模板）

按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环，PCR产物呈指数扩增。

模板DNA扩增倍数T=2n(n:循环次数)。2020/11/411PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension2020/11/412PCRproduct2020/11/413标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul2020/11/4142020/11/4152020/11/4162.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；RNA作为模板时，需要：RNAcDNAPCR,称此为RT-PCR.（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。逆转录2020/11/417酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少2020/11/418引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增2020/11/419引物设计的原则（一）①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右引物的有效长度不能大于38bpmer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃），不能保证PCR扩增产物的特异性②引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列2020/11/420引物设计的原则（二）④避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带⑤引物3’端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处2020/11/421引物设计的原则（三）⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好.引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会.2020/11/422引物在线设计网址：primer/primer3_2020/11/4232020/11/4242020/11/425dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低2020/11/426Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少2020/11/427PCR反应条件的选择PCR反应条件:温度时间循环次数2020/11/428温度与时间的设置：设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸2020/11/429①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败2020/11/430

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想2020/11/431引物的复性温度

通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。2020/11/432③延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些2020/11/433循环次数循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多2020/11/434（6）参数

变性温度与时间

一般选择：940C，30秒退火温度与时间

取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择：Tm-5℃

延伸温度与时间

一般选择：70℃

75℃循环次数

取决于模板浓度，一般循环：30次2020/11/435PCR反应特点特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低2020/11/436PCR产物分析凝胶电泳分析法

可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。同时应以