微生物实验技术一

微生物实验技术一第1页/共73页微生物实验技术（一）第2页/共73页一、显微镜技术光学显微镜技术普通光学显微镜技术相差显微镜技术荧光显微镜技术电子显微镜技术第3页/共73页1.普通光学显微镜技术

（lightmicroscopy）结构光学放大系统：物镜（油镜、高倍镜和低倍镜）和目镜（10×、16×）照明系统：光源、反光镜和聚光器机械和支架系统第4页/共73页第5页/共73页第6页/共73页第7页/共73页第8页/共73页分辨率分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。

D=0.61λ/(n·sinθ)D：分辨率

λ：波长

n：物镜与物体间介质折射率

2θ：物镜镜口角

N.A：即n·sinθ，数值孔径2θ最大值=140℃，空气中n=1，最短的可见光波长λ=450nm，分辨率D=292nm，约0.3um油镜：n=1.52，D=0.2um普通光镜的最大分辨率D=0.2um第9页/共73页第10页/共73页2.相差显微镜技术

（phase-contrastmicroscopy）相差显微镜与普通显微镜的区别：在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，表现出肉眼可见的明暗区别。相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差，即明暗差别。相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞及细胞内的某些细微结构。光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。第11页/共73页第12页/共73页3.荧光显微镜技术

(fluorescencemicroscopy)仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统原理：荧光物质，激发光，发射光利用一个高发光效率的点光源（高压汞灯），以最小表面释放出最大数量的紫外光（365nm）和蓝紫光（420nm），经过滤色系统，作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察，这种荧光在显微镜下很容易辨认，敏感性高，能对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察。荧光：自发荧光：通过激发光使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A诱发荧光：通过诱导剂作用而发出的荧光，如甲醛蒸汽处理诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光荧光染料染色荧光：丫啶橙对细胞DNA、RNA同时染色后，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。第13页/共73页第14页/共73页第15页/共73页第16页/共73页4.电子显微镜技术

（electronmicroscopy）原理：使用波长比可见光短得多的电子束作为光源（波长一般小于0.1nm），用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图象需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。分辨率：0.2nm；放大倍数106倍。人眼分辨率0.2mm；光学显微镜分辨率0.2um，放大倍数1000倍。基本构造电子束照明系统：电子枪、聚光镜成像系统：物镜、中间镜、投影镜真空系统：用两级真空泵抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空。记录系统：用荧光屏显示或感光胶片作记录。第17页/共73页电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别

分辨本领光源透镜真空成像系统光学显微镜200nm可见光玻璃透镜不要求利用样品对光的吸收形

(λ:400-700nm)成明暗反差和颜色变化

100nm紫外光玻璃透镜不要求

(λ约200nm)

电子显微镜约0.1nm电子束电磁透镜1.33×10-5~利用样品对电子的散

(λ:0.01~0.9nm)1.33×10-3Pa射和透射形成明暗反差第18页/共73页第19页/共73页超薄切片技术固定--脱水--包埋--切片--染色固定：要求保持样品的形态结构不发生改变，常用固定剂为戊二醛和锇酸等，通常在低温下固定。包埋：使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包埋剂为环氧树脂。包埋剂多与水不相溶，所以包埋前要经过一系列脱水处理。切片：厚度通常为40~50nm，常用玻璃刀。染色：用重金属盐进行染色以形成明暗反差。样品中不同成分对染料有不同亲和性（脂肪：锇酸；蛋白质：铅盐；核酸：醋酸铀）第20页/共73页第21页/共73页第22页/共73页第23页/共73页第24页/共73页冷冻蚀刻技术方法冷冻—快速低温冷冻法将样品在液氮或液氦中迅速冷冻断裂—低温下断裂蚀刻：在真空中冰升华复型用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上进行电镜观察。冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，样品不需包埋、固定，能更好地保持样品的真实结构。第25页/共73页第26页/共73页第27页/共73页第28页/共73页第29页/共73页第30页/共73页第31页/共73页负染色技术负染色：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸钠等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在暗的背景下显示标本的形态结构。主要用于颗粒状标本（细菌、病毒、分离的细胞器等）的研究。第32页/共73页第33页/共73页二、常用的微生物染色法简单染色法革兰氏染色法负染色法第34页/共73页细菌的观察方法水浸片（压滴法）：在载玻片中央滴一滴无菌水，再在其中加入少许菌体，使其均匀分布在无菌水中，盖上盖玻片，镜检。悬滴法：把要观察的含菌液体，滴在盖玻片上，然后把它翻过来，放置在凹孔载玻片上，使液滴悬挂在凹孔室内。染色法：观察细胞细致形态和主要构造。第35页/共73页1.简单染色法简单染色法：只用一种染料处理菌体，适用于一般观察。涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检第36页/共73页革兰氏染色法革兰氏染色法：由丹麦医生C.Gram于1884年创立，其基本操作分为初染、媒染、脱色和复染四个步骤。甲菌G+

初染媒染

脱色复染结晶紫碘液乙醇沙黄乙菌G-

第37页/共73页革兰氏染色法的原理通过初染和媒染后，在细菌细胞的膜或原生体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩，又由于其基本不含类脂，故在用乙醇处理时不会在壁上溶出缝隙，因此结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞壁内，呈紫色；G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔不易收缩，加上其类脂含量高，乙醇把类脂溶解，在细胞壁上出现较大缝隙，结晶紫与碘复合物极易被溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞呈无色，再经沙黄等染料复染后呈红色。第38页/共73页第39页/共73页第40页/共73页第41页/共73页负染色法负染色法（荚膜染色法）：用有色背景衬托无色荚膜。第42页/共73页三、培养基培养基：一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。因此任何培养基都应具备微生物所需的六大营养要素，且其间的比例是合适的。选用和设计培养基的四个原则：目的明确营养协调

C/N比=C源中C原子摩尔数/N源中N原子摩尔数经济节约以粗代精，以“野”代“家”，以废代好，以简代繁，以烃代粮，以纤代糖，以氮代朊，以“国”代“进”物理化学条件适宜：pH、渗透压、水活度选用和设计培养基的四个方法：生态模拟、查阅文献、精心设计、试验比较第43页/共73页目的明确培养对象：四大类微生物所需C源、N源、C/N比、生长因子、pH、渗透压都不同。用途实验室研究：不必过多地计较其成本一般培养用：天然培养基遗传代谢或生理研究：合成培养基发酵生产种子培养基：N源丰富（C/N比低）生产代谢产物含碳的代谢产物：碳源丰富含氮的代谢产物：氮源丰富加入特定元素、特定前体物质第44页/共73页pH微生物生长的最适pH值不同。细菌：pH7.0~8.0，放线菌：pH7.5~8.5，酵母菌：

pH3.8~6.0，霉菌：pH4.0~5.8微生物生长代谢过程中，会引起培养基pH的变化。糖类发酵、氧化有机酸有机物脂肪水解有机酸培养基内蛋白质脱羧胺类中性成分(NH4)2SO4NH4+选择吸收H2SO4

无机盐

NaNO3NO3-选择吸收NaOH

加磷酸缓冲液内源调节调节加CaCO3或NaHCO3

外源调节：按实际需要流加酸液或碱液*：培养基配好后，先用稀酸或稀碱（10%）调pH.第45页/共73页渗透压（Osmoticpressure）渗透压：由于溶质浓度差而在细胞膜两侧造成的压力差。渗透压的大小与溶液中分子或离子的质点数有关。等重的物质，其分子或离子越小，则质点数越多，渗透压越大。低渗溶液：外界浓度低，细胞吸水膨胀。等渗溶液：适宜微生物生长。高渗溶液：外界浓度高，细胞失水，发生质壁分离。第46页/共73页水活度aw水活度aw：表示在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。自由水：微生物可利用。 细胞内水分状态结合水：微生物不能利用。

aw定量：在相同温度和压力下，某溶液的蒸汽压P与纯水蒸汽压P0之比，也等于溶液的百分相对湿度。

aw=P/P0=ERH/100

纯水：aw=1，无水：aw=0，∴0<aw<1

各种微生物生长繁殖的aw值范围：0.998~0.6第47页/共73页培养基的种类根据培养基的成分分：天然培养基（complexmedium或undefinedmedium）：利用动植物或微生物或其提取物制成的培养基，人们无法确切知道其中的成分。如：培养细菌的肉汤蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基。组合培养基（合成培养基或综合培养基）（definedmedium）：一类用多种高纯化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。如：培养放线菌的高氏一号培养基、培养霉菌的察氏培养基。半组合培养基（semi-definedmedium）：既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。如：培养真菌的马铃薯蔗糖培养基第48页/共73页根据培养基外观的物理状态分：液体培养基（liquidmedium）半固体培养基（semi-solidmedium）：液体培养基+0.2~0.5%琼脂固体培养基（solidmedium）：凝固培养基：液体培养基+1.5~2%琼脂（5~12%明胶）非可逆性凝固培养基：用血清或硅胶作凝固剂天然固体培养基：用麸皮、米糠、木屑等配制而成。第49页/共73页根据培养基功能分：选择性培养基（selectedmedium）：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。方法：投其所好，取其所抗。鉴别性培养基（differentialmedium）：培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似的它种菌落相区分的培养基。如：伊红美蓝乳糖培养基（EMB培养基）——鉴别肠道菌。第50页/共73页第51页/共73页灭菌与消毒灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物（包括病原微生物和非病原微生物）永远丧失其生长繁殖能力的措施。消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。如：巴氏消毒法防腐：利用某种理化因素（低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、防腐剂）完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。第52页/共73页干热灭菌法原理：高温使微生物细胞内的蛋白质和核酸等生物大分子发生变性、破坏。细胞内蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。在湿热条件下，菌体吸收水分，蛋白质易凝固；湿热的穿透力比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在。1克水在100℃时，由气态变为液态可放出2.26KJ的热量。第53页/共73页火焰灼烧法：直接在火焰上灼烧灭菌。适用范围：接种针（环），试管口，三角瓶口，金属小工具。第54页/共73页烘箱内热空气灭菌法：160℃2h，适用于耐高温器皿。注意：温度不可超过180℃，超过180℃，玻璃器皿上的棉塞及外面包的纸张均会被烤焦着火。由于热空气穿透力弱，灭菌时物品不宜堆放得太紧。降温要缓慢，以免玻璃破裂，待温度＜60℃时，方可打开箱门。第55页/共73页湿热灭菌法煮沸消毒法：一般用于饮用水的消毒，100℃15min以上。间歇灭菌法：适用于不耐热培养基。

80~100℃15~60min室温或37℃过夜巴氏消毒法（Pasteurization）高压蒸汽灭菌法（Autoclave）重复三次培养基彻底灭菌第56页/共73页巴氏消毒法（Pasteurization）目的：杀死无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），不影响食品风味。方式低温维持法（LTH）：63-66oC,30min高温瞬时法（HTST）：72oC,15sec用途：用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法。第57页/共73页高压蒸汽灭菌法（Autoclave）仪器：高压蒸汽灭菌锅1.05kg/cm2或15磅/英寸2，即121oC，15-20min注意事项：灭菌前应先排尽锅内空气第58页/共73页第59页/共73页第60页/共73页影响加压蒸汽灭菌的因素灭菌物体的含菌量：含菌量↑，灭菌时间↑灭菌对象的pH：pH<6，微生物易死亡；pH6.0~8.0，微生物不易死亡灭菌对象的体积：影响热传导率加热与散热速度灭菌锅内空气排除程度的影响：加压蒸汽灭菌不是靠蒸汽压力，而是靠蒸汽温度，灭菌时要先排尽锅内空气，否则压力表上压力=锅内水蒸汽压力+空气压力↓↓压力表上温度锅内温度第61页/共73页灭菌物体含菌量的影响芽孢数目和灭菌时间的关系芽孢数/ml在100℃下杀菌时间（分）

10000000019750000001650000000142500000012100000081000006第62页/共73页pH对灭菌时间的影响

温度芽孢数灭菌时间（分）（℃）（个/ml）pH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150第63页/共73页灭菌对象体积的影响不同容量的液体的灭菌时间容器（ml）在121~123℃下所需灭菌时间（分）三角烧瓶

5012~1420012~1550017~22100020~25200030~35血清瓶

900050~55第64页/共73页空气排除度对灭菌温度的影响

压力表读数锅内温度（℃）

kg/cm2磅/英寸2纯蒸汽排除1/2空气不排除空气

0.35510994720.7010115105901.05151211121001.40201261181091.75251301241152.1030134128121第65页/共73页高温对培养基成分的影响形成沉淀物牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁等天然培养基灭菌后，发生沉淀。（一般不影响微生物生长）培养基中含Ca、Mg、Fe、Zn等离子，加热后易形成磷酸盐、碳酸盐沉淀。破坏营养，提高色泽褐变：含糖较高的培养基灭菌后，颜色发生变化，如黄、褐色，一般颜色越深，发酵效果越差。原因：还原糖的羰基与氨基酸或蛋白质的氨基反应→氨基糖（褐色）；部份糖分解→焦糖改变培养基pH：灭菌后，培养基pH下降0.2~0.3降低培养基浓度：气温低时会增加冷凝水第66页/共73页灭菌温度和时间对营养成分破坏的影响灭菌温度（℃）灭菌时间（分）营养成分的破坏（%）

10040099.3110306711515501204271300.