微生物检验与临床石屏

微生物检验与临床石屏第1页/共87页微生物检验

与临床第2页/共87页机遇与挑战并存感染病因的复杂免疫力低下的人群急剧上升全民关注感染问题相关部门的重视未知病原的鉴定临床要求有效时间内的有效报告细菌检验人员技术面和设备不能满足临床要求信任危机第3页/共87页现代感染的特点新感染性疾病:SARS、禽流感、猪流感已被征服的疾病卷土重来：结核、性病、炭疽低免疫人群急剧上升：艾滋病、移植患者动物微生物向人类的袭击细菌耐药、经验性用药失败、细菌培养阳性率低、细菌报告至少3天，离8h出报告相差很远第4页/共87页思考？我们应该如何面对挑战?第5页/共87页

抗生素的发现

1944年Waksman自灰链霉菌培养中分离出可拮抗结核杆菌的链霉素，于1952年荣获诺贝尔医学奖1947年发明氯霉素1947年发现多粘菌素1948年发现金霉素1949年发现新霉素

1950年发现土霉素。。。微生物学发展中的大事件第6页/共87页1943年青霉素大规模使用，1945年院内感染的20%金黄色葡球菌对其产生抗性1947年链霉菌素上市，同年该药耐药菌出现1952年四环菌素上市，1956年其耐药菌出现1959年甲氧西林上市，1961年其耐药菌出现抗生素使用与细菌耐药变化第7页/共87页1964年头孢噻吩上市，1966年其耐药菌出现1967年庆大霉素上市，1970年其耐药菌出现1981年头孢噻肟上市，1983年其耐药菌出现1996年，发现万古霉素耐药菌2001年利奈唑胺上市，2002年其耐药菌出现抗生素使用与细菌耐药变化第8页/共87页逐步上升到用20万、100万、400万、以及更高单位才能控制，甚至对青霉素产生耐药性随着抗生素特别是二代与三代头孢菌素的广泛使用，导致了多重耐药菌的不断增多并迅速扩散，它对许多抗生素产生耐药性1943年用2万单位青霉素就能够控制的感染抗生素使用与细菌耐药变化第9页/共87页这些耐药菌、尤其是多重耐药及泛耐药菌，已经成为目前临床医生难以对付的“超级细菌”抗生素使用与细菌耐药变化第10页/共87页早在抗生素应用以前有些细菌就具有抗药基因早在人工合成的抗生素使用之前，细菌就与自然界中的一些天然抗菌成分以及其他微生物产生的抗菌物质广泛接触而获得了耐药基因.（如放线菌代谢产物、天然植物、中草药等）抗生素使用与细菌耐药变化第11页/共87页细菌耐药属于一种自然现象，是微生物进化的结果细菌的抗药性也是进化选择的结果，抗生素的滥用加剧了细菌耐药性的产生细菌在生长繁殖过程中会产生耐药性基因的突变，在使用抗生素的选择压力下，耐药性细菌被筛选出来并优势繁殖抗生素使用与细菌耐药变化第12页/共87页细菌耐药已成为21世纪全球关注的热点对人类生命健康所构成的威胁绝不亚于艾滋病，癌症和心血管疾病防止滥用抗生素而造成耐药菌的出现及快速传播、不断研究开发新的抗菌药物是战胜细菌耐药的重要途径抗生素使用与细菌耐药变化第13页/共87页第14页/共87页抗菌药物临床应用管理办法第三章抗菌药物临床应用管理第十六条

……三级医院抗菌药物品种不得超过50种；二级医院不得超过35种，同一通用名称药品的品种，注射剂型和口服剂型各不得超过2种，处方组成类同的复方制剂1-2种。具有相似或相同药学特征的药品不得重复采购。第二十八条……医疗机构住院患者抗菌药物使用率不得超过50%……门诊抗菌药物处方比例不得超过15%。第15页/共87页抗菌药物临床应用管理办法第三章抗菌药物临床应用管理第二十九条二级以上医院应当开展细菌耐药监测工作，定期发布细菌耐药信息，建立细菌耐药预警机制，针对不同的细菌耐药水平，采取不同应对措施。对接受抗菌药物治疗的患者中，微生物检验样本送检率不得低于30%。（一）对主要目标细菌耐药率超过30%的抗菌药物，应及时将预警信息通报本机构医务人员。（二）对主要目标细菌耐药率超过40%的抗菌药物，应慎重经验用药（三）对主要目标细菌耐药率超过50%的抗菌药物，应参照药敏试验结果选用。（四）对主要目标细菌耐药率超过75%的抗菌药物，应暂停该类抗菌药物的临床应用，根据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复其临床应用。第16页/共87页内容：1.血培养—早期诊断的重要工具2.建立微生物实验室常规POCT检测项目3.正确把分子生物学的技术用于病原检测4.如今的微生物室还能为临床提供什么？第17页/共87页1.血培养—早期诊断的重要工具

第18页/共87页在新形势下

重新审视血培养第19页/共87页血培养诊断败血症败血症是一个非常严重的问题..血液中的微生物在3分钟内到达每个器官..在死于败血症的患者中,尽管采用抗生素给与合适的治疗，1/4的人死亡时，血中循环的微生物为10cfu/ml或更多。第20页/共87页明确血培养的临床意义血培养对以下疾病很重要—菌血症—感染性心内膜炎

—临床不明原因感染

—假体植入后感染（人工关节、人工瓣膜）

—静脉导管相关性菌血症

—肺炎血培养是最好的工具帮助他们用药、减少死亡

第21页/共87页指示预后健康人能在几分钟内将血中菌消失病人则不能将病原菌控制在原发部位医生未能将病原菌清除，如：—清除失败

—引流不成功死亡率与病原菌、药敏谱、基础病相关，亦即提供了预后信息第22页/共87页败血症由感染引起的全身感染发病率上升、在致死的主导因素中居第十位非冠脉意外的ICU中最多见的致死因素器官功能障碍的常见诱因第23页/共87页不同部位感染败血症发生率第24页/共87页当前血培养存在的问题采样时污染严重培养一次阴性作为诊断依据血液与培养基比例不正确采样时间不正确少做厌氧培养不能及时报告国际上仍然公认血培养是诊断血流感染的金标准！第25页/共87页采血指针发热（>38。C）或低温（<36。C）寒战白细胞增多皮肤黏膜出血昏迷多器官衰竭，血压降低，CRP升高及呼吸快特殊患者出现粒细胞减少，血小板减少等第26页/共87页第27页/共87页第28页/共87页皮肤和环境的细菌在严格的消毒条件下，仍有3%~5%的污染菌”：皮肤菌表皮葡萄球菌痤疮丙酸杆菌梭杆菌属类白喉群环境菌：革兰阳性杆菌、不动杆菌第29页/共87页皮肤和环境的细菌何种情况下考虑可能是菌血症的致病菌？对两次不同部位血培养生长同一种微生物其他无菌部位标本培养中生长同一种微生物微生物快速生长<=48小时实验室工作人员和医生之间进行交流沟通，结合临床讨论这些菌意义第30页/共87页血培养次数病特点

阳性率1套1+2套1+2+3套一般菌血症65%80%96%感染性心内膜炎80%2004年报告：163位病人，血培养仪第31页/共87页血培养次数怀疑菌血症的成人患者：采集2~3套血培养标本（不同部位）婴幼儿患者：采集两次血培养标本（不同部位）除特殊情况外，在采集血培养后的2~3天内，无需重复采集血培养可疑持续性菌血症：如心内膜炎、导管相关血流感染，间隔（1~24h）几次取血检测、捕捉、指导治疗第32页/共87页第33页/共87页第34页/共87页思考：第35页/共87页不仅培养厌氧菌可帮助提高兼性厌氧菌的阳性率16%链球菌•17%肠杆菌科细菌仅厌氧瓶报告阳性1.为什么必须同时做厌氧细菌?第36页/共87页菌血症病原菌种类构成需氧瓶厌氧瓶需氧菌兼性厌氧菌厌氧菌病原菌培养更完整第37页/共87页2.应该采集多少份血培养？答案：每名患者应至少采集2份血培养，最好为3份（CLSI规定采集2～3份血培养）在一名败血症患者初期诊断时，绝不能只采集1份血培养（CLSI强调了此观点）注意：1“份”是指一次静脉穿刺第38页/共87页血培养组合的累积敏感性

Weinsteinetal.DetectionofBloodstreamInfectionsinAdults:HowManyBloodCulturesAreNeededJClinMicrobiol.2007;45:3546-3548第39页/共87页3.第一次多瓶血液培养的意义提高阳性率识别定植菌或致病菌多瓶采样后的以后的2-5天不需采样,可提前获得病原学报告第40页/共87页4.每次采集血培养的间隔时间？答案：每份血培养间隔应不超过5分钟，因为网状内皮系统对于一过性菌血症和间歇性菌血症在15～30分钟内可清除（CLSI规定每份血培养应同时获得，或尽可能短的时间内）对怀疑亚急性感染性心内膜炎，间隔1小时，连续采集3份血培养第41页/共87页5.应采集多少血液？答案：血液量是使血培养得到最佳灵敏度的唯一最重要的因素对于大多数2份血培养瓶，每份应至少为10ml血液，最好为20ml血液，分注在两个血培养瓶内。2份血培养（4个血培养瓶）应至少接种20ml血液，最好为40ml血液。（CLSI规定每份血培养为20～30ml血液）第42页/共87页6.血液在需氧瓶和厌氧瓶中分配建议常规情况下，一份血培养应包括：1个需氧瓶和1个厌氧瓶（1次穿刺）当采血量不能满足推荐的采血量时，应首先满足需氧瓶的需要。注意：对于仅用需氧瓶的实验室来讲，每次采血必须注入2个需氧瓶中以确保足够量的采血量。第43页/共87页7.采血时机？细菌通常在寒战和发烧前1小时入血，此时为采血培养标本进行病原培养的最佳时机在考虑使用抗菌药物之前。立即采集血培养标本建议同时或间隔短时间内采集2套以上血培养标本第44页/共87页尽快送检做血培养的患者多数病情危急，采血后应立即送检，如不能立即送检，需室温保存或置35℃孵箱中，切勿冷藏第45页/共87页全自动血培养系统连续振荡孵育和检测同时进行，每10分钟检测一次，可及时发现阳性结果并报告无须盲传，减少了血培养污染机会2天内可报告90%以上的阳性结果培养基添加多种促细菌生长因子，适合各种细菌的生长可进行需氧菌、厌氧菌的培养，也可进行结核菌培养第46页/共87页血培养结果报告：三级报告第47页/共87页实验室类型: 美国私立大医院微生物实验室

医院病床数: 800beds

微生物标本量: 600个标本/天

血培养标本量: 150瓶/天

血培养标准采样: 3套瓶/24小时(1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套)

阳性结果: 10-30株需氧或兼性厌氧菌/天,2株厌氧菌/月

BacT/ALERT3D240 7台第48页/共87页

实验室类型: 美国大型独立实验室

标本来源: 14家中型医院和一些小诊所

微生物标本量: 8000个标本/天

血培养标本量: 1400瓶/天

阳性结果: 75-100个阳性结果/天

BacT/ALERT3D240 30台(5列,每列6台)第49页/共87页第50页/共87页第51页/共87页第52页/共87页第53页/共87页中国某三甲医院

微生物送检标本分布（3200床位）

（40,000标本/年）第54页/共87页我院2013年上半年送检情况（600床位）：第55页/共87页改善血培养报告质量，

关键在实验室；

提高血培养阳性率，

关键在临床！第56页/共87页疗效与药敏试验结果不一致的可能原因：并非真正的致病菌实验室质量控制剂量疗程问题需要联合用药治疗过程中产生耐药药物的PK/PD特性-所致肺组织浓度

-是否进入细胞内

-药物代谢受到干扰2.降钙素原（PCT）—早期诊断以及监测病情第57页/共87页2.建立微生物实验室常规POCT检测项目

第58页/共87页POCT

（Point-Of-careTesting）概念美国国家临床生化科学院(NACB)将POCT定义为:在接近病人治疗处，由未接受临床实验室学科训练的临床人员或者病人（自我检测）进行的临床实验室检验。POCT是在传统、核心或中心实验室以外进行的一切检验。第59页/共87页获得公认的POCT革兰染色降钙素元(PCT)1-3-β-D葡聚糖试验(G)试验和GM试验第60页/共87页临床希望第一时间知道的信息感染或非感染细菌感染或非细菌感染因为上述感染治疗方法不同第61页/共87页PCT的临床价值早期诊断在感染发生2-3h血浆PCT浓度就会升高.病情监测在脓毒血症和休克时PCT含量最高,随着感染的恢复PCT也随着下降.预后判断动物实验证明，PCT是一个潜在的致死因子，本身不会启动脓毒性反应但可放大并加重脓毒性的病理反应，当PCT含量升高时死亡率也升高。第62页/共87页不可能发生细菌性感染肺吸气量损伤患者可以出现不鼓励使用抗菌药物不太可能发生细菌性感染不鼓励使用抗菌药物可能存在细菌感染建议开始抗菌治疗细菌性感染强烈建议开始抗菌治疗PCT<0.1ng/ml0.1ng/ml≤PCT<0.25

ng/ml0.25ng/ml≤PCT<0.5

ng/mlPCT>0.5ng/mlPCT:参考值第63页/共87页降钙素原（PCT）

——作为炎性标志物的优势ReinhartK,etal.CritCareClin2006机体受到内毒素刺激后炎性标志物的动力学变化过程快速、高特异性的增长

在细菌感染情况下，PCT水平的增加可在感染后3至6小时内被检测到且随着感染的严重程度而增高快速衰减

半衰期约20-24小时，可以快速反映治疗效果疾病监控中，PCT有着天然的优势第64页/共87页注意：引起PCT升高的非感染因素促炎反应药物(OKT3,TNFα,IL-2,抗淋巴细胞球蛋白)严重肾衰、透析手术后，严重烧伤，多处外伤甲状腺细胞癌，小细胞肺癌，支气管癌长时间心源性休克、失血性休克、热休克等48h以内新生儿粒缺移植排异反应不会引起PCT升高65第65页/共87页1-3-β-D葡聚糖的临床价值早期诊断:先于临床诊断平均4天。敏感性和特异性:确诊和高度疑似的感染病例，单次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为100%、82%、40%和100%。